李莉 周豐 王曉今 徐以兵 施莉琴 李震宇 周桁 傅青春 陳成偉

肝惡性腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，由于其早期發(fā)現率較低，多數患者就診時已達中晚期，失去手術或放、化療的最佳時機，生物免疫治療是近幾年備受青睞的腫瘤治療新技術。NK細胞治療是其中的一種，NK細胞是具有直接殺傷功能的天然免疫效應細胞，在清除腫瘤細胞中起關鍵作用。有研究表明,NK細胞治療聯合傳統腫瘤治療手段能夠有效提高腫瘤治療效果[1]。謝云波等[2]指出，同種異體NK細胞治療原發(fā)性肝細胞癌有很好的安全性和有效性。本研究采用異體NK細胞治療肝惡性腫瘤患者10例，觀察其安全性和有效性。

資料與方法

一、研究對象

10例患者為2016年1月至2017年5月在905醫(yī)院肝病中心接受NK細胞治療且定期隨訪者，其中男性7例，女性3例；中位年齡為61.5歲。原發(fā)性肝癌6例，轉移性肝癌4例。既往治療：手術切除聯合介入治療5例，介入聯合射頻消融治療3例，化療聯合介入治療2例。本研究方案由905醫(yī)院倫理委員會批準(總后批件號：衛(wèi)醫(yī)療[2014]67號)及指導。

二、納入標準

①本人或其法定代理人簽署《知情同意書》；②年齡18～70歲；③經影像學或病理學確診為肝臟惡性腫瘤，符合下列任一條：a.腫瘤直徑≥5 cm或2個以上腫瘤且至少有一個直徑≥3 cm，行手術完全切除，1個月后常規(guī)TACE治療，無復發(fā)且無遠處轉移；b.未行手術切除或手術切除后復發(fā)，單個腫瘤直徑≥3 cm或多個腫瘤，TACE/消融后1個月，影像學檢查顯示病灶無活動，無遠處轉移；c.轉移性肝癌符合條件a或b但原發(fā)灶無活動性且無其他處轉移；④Child評分為A級或B級者；⑤外周血白細胞數>3×109/L；⑥患者一般狀況可，生存預期在3個月以上。

三、排除標準

①高度過敏體質或有嚴重過敏史，尤其對IL-2過敏者；②休克，全身衰竭，生命體征不正常，以及不能配合檢查者；③有精神或心理疾病不能配合治療及療效評估者；④T淋巴細胞癌/瘤；⑤全身感染或局部嚴重感染需抗感染治療患者；⑥合并心、肺、腦、腎、肝等重要臟器的功能障礙；⑦凝血功能障礙性疾病(如血友病)；⑧傳染性疾病(如HIV、RPR、活動性結核等)；⑨妊娠期或哺乳期婦女，或半年內有妊娠計劃的婦女；⑩正在使用免疫抑制藥物或器官移植后長期服用抗排異藥的患者；B嚴重自身免疫性疾病患者。

四、NK細胞培養(yǎng)

采集供者(患者直系親屬年齡為18～50歲)外周血100 mL，予上海宇研生物技術有限公司進行NK細胞培養(yǎng)及質控檢查。

五、NK細胞治療方案

細胞培養(yǎng)2周后，開始進行NK細胞回輸治療，每天1次，每次NK細胞數量均為1×109個/100 mL,連續(xù)2次為1個療程，共3個療程，每個療程間隔1個月。受試者分別在第一療程首次細胞輸注后的3個月、6個月、9個月、1年進行有效性的訪視觀察，整個臨床研究觀察持續(xù)3年。

六、療效評價

1.安全性評價

(1)不良反應觀察：靜脈回輸過程中及回輸后24 h內密切觀察患者是否出現發(fā)熱、皮疹、乏力、肌肉酸痛、嘔吐等不良反應。

(2)生活質量評估：用KPS評分及睡眠、食欲等的改變來評估生活質量的改善。

(3)臨床相關指標的檢測：治療前后常規(guī)檢查患者血常規(guī)(白細胞、中性粒細胞、單核細胞、血小板)，血生化(GLU/ALT/AST/A/TBil/DBil/Cr/BUN/)。

2.細胞治療前后循環(huán)腫瘤細胞(CTC)計數的變化：輸注后24 h CTC計數變化。

3.療效評價方法：患者治療前和治療后每3個月對病灶進行CT或MRI掃描，評估病情。臨床療效根據實體瘤療效評價標準:分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)。以CR+PR(%)計算有效緩解率(ERR)。

七、統計學方法

結 果

一、 安全性評價

1.不良反應觀察：1例患者細胞輸注后半小時出現畏寒、寒戰(zhàn)、胸悶，給予對癥處理，15 min后癥狀緩解體溫升高，最高至39.9℃，伴惡心、嘔吐，予以胃復安及泰諾處理后，癥狀逐漸消失，次日有輕度肌肉酸痛；1例出現失眠；其余患者耐受性較好，均無其他嚴重不良反應。

2.生活質量評價：治療前KPS評分為81.0±13.7，治療后KPS評分為87.0±11.9，差異無統計學意義(P>0.05)。其中5例患者疲倦、乏力及精神、食欲不振等臨床癥狀有明顯改善。

3.肝腎功能相關指標：治療前后患者血常規(guī)(白細胞、中性粒細胞、單核細胞、血小板)，及肝腎功能(GLU/ALT/AST/A/TBil/DBil/Cr/BUN/)檢測均無明顯改變。

二、治療前后CTC計數的變化

10例患者輸注后24 h測CTC數減少，回輸前為3～5個/mL，回輸后為1～3個/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。

三、療效評價

10例均接受異體NK細胞治療，所有患者經治療后隨訪3～36個月，經CT及MRI檢查，臨床療效為：3個月總體生存率100%，有效緩解率80%(無死亡，2例SD，3例PR，5例CR)，6個月總體生存率90%，有效緩解率80%(1例死亡，1例PD，3例PR，5例CR)； 12個月總體生存率80%，有效緩解率60%(2例死亡，2例PD，3例PR，3例CR)；36個月總體生存率50%，有效緩解率30%(5例死亡，2例PD，3例CR)。

討 論

據統計2015年我國肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別占惡性腫瘤的第四位和第二位[3]。肝癌早期診斷困難，病情進展迅速，盡管目前肝癌的診斷治療不斷取得進展，但進一步提高療效，特別是改善中晚期患者的預后仍面臨很多挑戰(zhàn)[4]。NK細胞占肝臟淋巴細胞總數的25%～50%，在肝臟免疫中發(fā)揮重要作用，NK細胞的衰竭和細胞因子的產生受損可能是肝癌發(fā)生的預測因子，肝癌患者外周血中的NK細胞數量與患者存活率和預后密切相關[5]。研究表明，肝癌患者的NK細胞活性顯著降低，提高NK細胞活性有助于預測肝癌患者肝切除術后的復發(fā)和預后[6]。目前增加NK細胞數量、提高NK細胞活力成為靶向NK細胞免疫治療的主要策略，如通過NK細胞過繼轉輸、免疫抑制劑、基因修飾NK細胞及使用雙特異性或三特異性抗體等增加NK細胞數量、增強NK細胞靶向性及NK細胞活性。NK細胞不僅能直接殺傷惡性病變細胞,還能參與調節(jié)免疫細胞應答,在多種腫瘤免疫治療策略中發(fā)揮了作用。研究表明，NK細胞治療對不同腫瘤的療效存在差異，在血液腫瘤的治療中發(fā)現，NK細胞聯合干細胞治療使患者2年的生存率達到36%，較單獨使用干細胞治療2年生存率(約15%)明顯提高，可使白血病患者無病生存期延長平均1.5年，對于復發(fā)難治型白血病可獲得高達40%的完全緩解率[7-9]。單獨使用NK細胞治療實體瘤效果欠佳，在有關直腸癌、食管癌、腎癌、胃癌等臨床試驗中，NK細胞過繼治療臨床應答不佳[10]。實體瘤治療效率低的主要原因考慮與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用有關[11]。因此，推測NK細胞聯合療法可能會增強療效。而傳統腫瘤治療手段包括手術、放化療，可以在一定程度上降低腫瘤負荷，也可以提高腫瘤細胞免疫治療療效。

本研究對10例肝惡性腫瘤在常規(guī)治療的基礎上進行異體NK細胞治療，有1例患者在輸注1 h內出現畏寒、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、惡心、嘔吐等癥狀，對癥處理后癥狀緩解，絕大多數無其他嚴重不良反應，有較好的耐受性；多數患者乏力、食欲不振及精神狀態(tài)差等臨床癥狀有明顯改善，患者短期內一般情況得到改善；此外，NK細胞回輸24 h后，患者外周血中的CTC減少,由輸注前3～5個/mL下降至1～3個/mL。Zhou等[12]的研究發(fā)現,手術前CTC及調節(jié)性T細胞計數較高的肝癌患者發(fā)生術后復發(fā)的風險高于低計數水平患者,且EpCAM+CTC≥2.22/mL是 患者術后1年內復發(fā)的獨立危險因素。Hao等[13]的研究結果則顯示,EpCAM+CTC≥3.5個/mL的肝細胞癌患者手術切除后的復發(fā)率高于<3.5個/mL的患者。也有研究顯示,肝癌細胞在疾病早期即可從實體瘤中脫離并進入外周循環(huán)而成為CTC,即使在未發(fā)生遠處轉移的情況下,肝癌患者的CTC計數亦可長期處于較高水平,且CTC計數在肝細胞癌的臨床診斷及預后評估中也具有較高的價值[14-15]。本研究納入病例數較少，NK細胞治療對于肝癌復發(fā)及預后的遠期影響，還需要通過加大樣本量、隨機對照試驗、增加NK細胞療程等進一步加以證實。