常雋 張文婷

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cirrhosis, PBC)是肝內(nèi)直徑40～80 μm小膽管的非化膿性特異性免疫性損傷，此病呈進行性發(fā)展，最終發(fā)展至肝硬化[1-2]。肝纖維化是由多種致病因子所導致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，其不是一個獨立的疾病，而是一個病理生理過程[3-5]。尋找一種方法能夠在肝纖維化演進為肝硬化的過程進行準確評估，為臨床有針對性的選擇治療方案，具有重要意義[6-7]。常規(guī)超聲是臨床評估慢性乙型肝炎患者病情的常規(guī)手段，但常規(guī)超聲難以準確評估肝纖維化分期[8]。因此單獨依靠常規(guī)超聲難以滿足臨床需求。溶酶體膜蛋白-2 (Lysosomal Granule Membrane Protein，LAMP2)主要在胎盤、肺和肝臟表達，既往認為該蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，近期研究認為LAMP2除了履行結(jié)構(gòu)蛋白功能外，還參與自身免疫疾病，自噬體形成、內(nèi)體融合、膽固醇運輸、肝纖維化等生理病理過程[9]。此外，也有研究表明聲輻射力脈沖成像(Acoustic radiation force impulse，ARFI)與乙型肝炎纖維化病情進展相關(guān)。在此背景下，本研究旨在分析常規(guī)超聲聯(lián)合LAMP2、ARFI在PBC患者肝纖維化程度監(jiān)測中的價值，為臨床準確評估PBC患者肝纖維化程度提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選擇2016年2月至2019年4月在本院進行治療的，經(jīng)肝穿刺病理組織學檢查確診為PBC的96例患者的完整資料進行回顧性分析。根據(jù)Child-Pugh分級分為A級41例、B級24例，C級31例，其中男性62例，女性34例，年齡60～80歲，平均(64.2±4.3)歲，中位年齡74歲。另隨機選取在本院進行健康體檢的患者60例作為對照組，其中男性34例，女性26例，年齡61～82歲，中位年齡73歲，平均年齡(65.1±3.9)歲。入組患者及家屬均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。

二、納入與排除標準

納入標準：入組患者符合2000年美國肝臟病學會關(guān)于PBC的指導意見，具體如下：(1) 反映膽汁淤積的生化指標上升持續(xù)超過半年；(2) B超或者膽管造影結(jié)果表明患者膽管系統(tǒng)排泄正常; (3) 入組患者血清AMA或AMA-M2陽性；(4) 肝臟穿刺檢查符合PBC病理特征。排除標準：(1) 伴有自發(fā)腹膜炎、結(jié)核等疾病者；(2)伴有肝癌或其他腫瘤者。

三、觀察指標及方法

(一)常規(guī)超聲檢查 入組患者在肝臟活檢前后1周內(nèi)實施常規(guī)超聲檢查，重點觀察“肝包膜、肝實質(zhì)”圖像，肝包膜使用高頻線陣探頭，選擇最容易被觀察的劍突下肝左葉，探頭垂直肝臟。采用低頻凸陣探頭探查肝實質(zhì)，在右肋間切面觀察。采集圖像存儲后，分別由兩位醫(yī)生對存儲的圖像采取雙盲法進行半定量評分，具體評分標準如下表，分別對肝包膜，肝實質(zhì)和脾面積進行計分，總分為超聲得分。

超聲指標1分2分3分肝包膜光滑欠光滑鋸齒狀肝實質(zhì)均勻欠均勻結(jié)節(jié)狀脾面積<20 cm2≥20 cm2

(二)免疫組化法檢測 LAMP2在肝組織的表達，LAMP2陽性信號存在于肝細胞胞漿，為棕黃色顆粒，由兩位病理科醫(yī)生對免疫組化結(jié)果進行判斷，評分內(nèi)容包括兩部分；一為細胞染色強度，分陰性、若陽性、陽性和強陽性，分別對應(yīng)0分、1分、2分和3分。二為在高倍顯微鏡下選擇3個以上的視野，計算陽性細胞百分比，分為4個等級，陽性細胞百分比分別為：0.01%～25%，25.01%～50%，50.01%～75%，75.01%～100%。最終評分由染色強度和陽性細胞數(shù)百分比對應(yīng)數(shù)值是乘積，依據(jù)得分劃分為陰性(0～1分，—)，弱陽性(2～4分，+)，陽性(5～8分，++)，強陽性(9～12分，+++)。

(三)使用彩超ARFI成像檢測與肝組織硬度直接相關(guān)的剪切波速(shear wave velocity, AWV)，探頭4Cl，頻率3.0-4.5 MHz。檢查時安排受檢者平臥，平靜呼吸時屏氣，避開血管及膽管，s5、s6、s7、s8肝段每段測量3次，取均值作為肝臟ARFI值。

(四)肝穿刺活檢 采用經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)，一般要求組織長度1.5 cm以上，所取組織應(yīng)包括10個以上的完整匯管區(qū)，過程中注意排除破碎的肝組織標本，標本經(jīng)石蠟包埋后進行連續(xù)切片，進行常規(guī)HE染色，參照“病毒性肝炎防治方案”[10]進行肝纖維化分期。

四、 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、PBC與對照組患者ARFI及LAMP2及超聲積分比較

如下表所示，可見，PBC患者ARFI，LAMP2和超聲積分均高于對照組，統(tǒng)計學分析結(jié)果表明差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

二、不同Child-Pugh分級PBC患者LAMP2、ARFI及超聲積分比較

如表2所示，本次研究中，經(jīng)F檢驗可知，PBC患者中不同Child-Pugh分級者，對比他們的ARFI，

表1 PBC與對照組患者ARFI及LAMP2及超聲積分比較

表2 不同Child-Pugh分級PBC患者LAMP2、ARFI及超聲積分比較

LAMP2和超聲積分水平，結(jié)果提示相關(guān)指標在不同分級患者之間的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。t檢驗結(jié)果表明，Child-Pugh為B級的患者ARFI，LAMP2和超聲積分均顯著高于A級患者(P<0.05)，Child-Pugh為C級的患者ARFI，LAMP2和超聲積分均顯著高于A級和B級患者(P<0.05)。

三、LAMP2、ARFI和超聲積分水平與PBC患者病理分期的相關(guān)性

相關(guān)分析中使用Pearson相關(guān)性方法進行，對LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC肝臟病理分期的潛在聯(lián)系進行分析，結(jié)果表明LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC患者Child-Pugh分級均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 LAMP2、ARFI及超聲積分與PBC肝臟

四、ROC曲線分析法用于討論LAMP2、ARFI和超聲積分水平診斷PBC患者肝纖維化狀態(tài)的價值

如下表，采用ROC曲線分析LAMP2、ARFI和超聲積分水平聯(lián)合對肝纖維化進行診斷，ROC曲線分析可見，同時聯(lián)合檢測的方法對于PBC患者肝纖維化程度的診斷評估均具有更高的診斷效力，其靈敏度以及準確度、特異度分別為0.874、0.931、0.922，均顯著高于三個指標單獨檢測。

表4 ROC曲線分析LAMP2、ARFI及超聲積分

討 論

臨床上，PBC患者的病理變化以進行性、非化膿性和破壞性的肝內(nèi)小膽管損傷為典型病理特征，病情嚴重，可惡化為肝硬化。病理檢查固然是當前PBC診斷中不可動搖的權(quán)威公認金標準，但其也有致命缺陷。此外，由于PBC的臨床前期和無癥狀期不存在不適癥狀，因此對PBC進行早期診斷較為困難。因此本研究結(jié)合此前有關(guān)PBC病理的研究結(jié)果，探討常規(guī)超聲，LAMP2以及ARFI應(yīng)用于肝纖維化程度動態(tài)監(jiān)測的可行性及臨床價值。

研究通過回顧性分析，了解到于我院進行治療的96例PBC患者，PBC患者ARFI，LAMP2和超聲積分均高于對照組。本研究表明不同病情PBC患者ARFI、LAMP2和超聲積分差異顯著。C級的患者ARFI、LAMP2和超聲積分比A和B級患者水平更高，同時ARFI以及LAMP2、超聲積分水平可見C等級的受試對象高于A和B級受試對象。所以在不同Child-Pugh分級的PBC患者中，這三個重要的特征性指標(ARFI，LAMP2以及超聲積分)均存在明顯差異，這一結(jié)果提示上述3指標具有應(yīng)用于臨床動態(tài)監(jiān)測肝纖維化程度的可能。為進一步分析ARFI，LAMP2和超聲積分與PBC患者肝纖維的相關(guān)性，本研究在賦值后進行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明結(jié)果表明LAMP2、ARFI及超聲積分與Child-Pugh分級是正相關(guān)的。使用ROC曲線評估了3個指標對PBC病情評估的價值，可見聯(lián)合檢測方案的靈敏度、準確度、特異度均顯著高于單獨檢測。上述結(jié)果表明可采用ARFI，LAMP2聯(lián)合超聲積分對PBC患者動態(tài)纖維化程度進行動態(tài)監(jiān)測，以達到指導臨床治療的目的。常規(guī)超聲對于PBC的診斷，主要是根據(jù)其在不同病理分期的不同超聲特征[11]，總體而言，PBC患者肝臟實質(zhì)回聲增強，可見細密結(jié)節(jié)狀，肝內(nèi)膽管伴有輕度擴張，膽管壁水腫，回聲增強。伴隨病情變化，肝血流動力學也逐漸發(fā)生變化。ARFI利用發(fā)射的低頻聲脈沖使目標區(qū)組織產(chǎn)生位移，再利用追蹤波束獲得組織位移情況，從而計算得到目標區(qū)與周圍組織相對硬度圖像及目標區(qū)組織的剪切波速度值[12-14]，因此其能夠通過測量肝實質(zhì)硬度值間接反映肝臟纖維化程度和其儲備功能。本研究結(jié)果也表明超聲評分與PBC患者Child-Pugh分級呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

盡管LAMP2具體功能尚不十分清楚，此前研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體膜蛋白成分中50%為LAMP1與LAMP2，因此 LAMP2作為溶酶體膜的重要成分參與維持溶酶體膜的正常結(jié)構(gòu)，同時其分子的腔內(nèi)段結(jié)構(gòu)存在高度糖基化特點，保護溶酶體膜降解風險和降解程度更低。近年來研究發(fā)現(xiàn)[15]，LAMP2不單純作為一種結(jié)構(gòu)蛋白存在于膜結(jié)構(gòu)中，同時還在很多免疫性疾病與病理過程中直接調(diào)控中性粒細胞的黏附、自噬作用，并且與抗原遞呈也有關(guān)聯(lián)[16], 因此被作為一種新的ANCA亞型提出。既往有實驗性研究選取LAMP2基因缺陷的小鼠為研究對象，分析其與小鼠免疫功能的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn) LAMP2對細胞自噬作用會產(chǎn)生重要影響，是自噬過程中不可或缺的關(guān)鍵因子之一。研究還顯示[17]，自噬在膽管上皮細胞損傷中會出現(xiàn)，并且自噬降解的調(diào)節(jié)異常與線粒體異常抗原的表達有關(guān)，可能參與PBC小膽管損傷過程。一定程度上解釋了LAMP2在肝組織中的表達與PBC患者肝纖維化的關(guān)聯(lián)機制。

綜上所述，可以得出結(jié)論，常規(guī)超聲聯(lián)合LAMP2、ARFI可準確評估PBC患者肝纖維化程度。但需要注意的是Child-Pugh分級并不能對肝硬化的嚴重程度進行全面體現(xiàn)，因此在后續(xù)的研究中，需要選擇更為可靠的評價指標，進一步分析LAMP2，ARFI和超聲積分與肝纖維化的相關(guān)性及其重要意義。