李旖梅，王召軍，閆筱筱，張洪映，李雪君，孫計平，黃明月，崔紅*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；

2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000；

3 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄廠，四川省德陽市什邡市鎣華山路南段128號 618400

煙草葉面化學(xué)成分豐富，主要由二萜化合物、蔗糖酯、蠟質(zhì)、微元素、揮發(fā)性化合物等構(gòu)成[1]。其中，二萜化合物和蔗糖酯在葉面腺毛中特異地合成，作為腺毛分泌物構(gòu)成了葉面化學(xué)成分的主要部分[2]。煙草二萜化合物由西柏烷類化合物和賴百當(dāng)類化合物組成，作為重要的香氣前體物，二者對煙葉香氣品質(zhì)具有不同的影響[3]。西柏三烯二醇是主要的西柏烷類化合物，其降解產(chǎn)物茄酮具有青香、草香及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等具有甜香和酮香等特殊的香味；順冷杉醇、賴百當(dāng)二醇是主要的賴百當(dāng)類化合物，其降解產(chǎn)物降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯、脫氫龍涎香內(nèi)酯等都具有強烈的龍涎香香氣[3]。西柏烷類和賴百當(dāng)類化合物在不同煙草類型之間的分布也不相同。西柏烷類化合物在烤煙、白肋煙、雪茄煙、香料煙中廣泛存在，但在烤煙中含量最高；賴百當(dāng)類化合物則主要存在于香料煙和雪茄煙中，烤煙中基本不含有賴百當(dāng)類化合物[4]。二萜化合物的不同特性及其在不同煙草類型之間的顯著差異，表明其與煙草的香氣風(fēng)格密切相關(guān)。

8306 是以葉面化學(xué)成分為目標(biāo)選育出來的烤煙品系，其葉面腺毛分泌物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于K326、云煙87 等烤煙品種[5]。以其為父本與K326 雜交選育出來的雜交種“豫煙11”具有高分泌、高香氣的特點[6]。但其香氣風(fēng)格具有晾曬煙的特征，在一定程度上影響了其工業(yè)可用性。李艷華[7]等對我國主要烤煙品種葉面化學(xué)成分的比較分析表明，紅花大金元、中煙100、翠碧1 號和K326 等品種的二萜化合物主要是西柏烷二萜，包括α，β-西柏烷三烯一醇和α，β-西柏烷三烯二醇，唯有在豫煙11 中檢測到了順冷杉醇和賴百當(dāng)二醇的存在；進(jìn)一步對二萜化合物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析證明，煙草柯巴基焦磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase 2，NtCPS2），僅在豫煙11 中呈現(xiàn)出高表達(dá)，而在其余4 個烤煙品種中的表達(dá)水平極低。由此推測，NtCPS2 基因的高表達(dá)是導(dǎo)致豫煙11中賴百當(dāng)類化合物的合成及晾曬煙風(fēng)格產(chǎn)生的關(guān)鍵，而該性狀主要來源于其父本8306，與其母本K326無關(guān)。

NtCPS2 是煙草賴百當(dāng)二萜合成的關(guān)鍵酶，它催化焦磷酸香葉基香葉酯（geranylgeranyl-PP，GGPP）形成8-羥基-古巴內(nèi)脂焦磷酸（8-α-hydroxy-copalylpyrophophate，簡稱8-OH-CPP），在NtABS 的催化作用下，生成順冷杉醇和賴百當(dāng)二醇[8]（如圖1）。

圖1 煙草二萜合成途徑Fig. 1 The biosynthetic pathway of tobacco diterpenes

8306 作為重要的高分泌型烤煙育種材料，阻斷其賴百當(dāng)類化合物的生物合成，定向改良其葉面化學(xué)成分，對烤煙高香氣育種具有重要意義。因此，本研究采用基因編輯技術(shù)敲除8306 中的NtCPS2 基因，對獲得的NtCPS2 基因純合突變材料進(jìn)行了農(nóng)藝性狀、葉面化學(xué)和基因表達(dá)等檢測分析，為豫煙11 的香氣品質(zhì)改良及高香氣烤煙選育奠定了基礎(chǔ)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料煙草8306 種子，經(jīng)無菌水、75%酒精和次氯酸鈉消毒后，在組培瓶中萌發(fā)成苗。無菌苗培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%，光照條件為16 h 光/8 h 暗。

1.2 試驗方法

1.2.1 NtCPS2 敲除載體的構(gòu)建和菌株轉(zhuǎn)化

根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站（https://solgenomics.net/）已發(fā)表的煙草NtCPS2基因序列（Nitab4.5_0001630g0010.1、Nitab4.5_ 0006403g0010.1）， 利 用 CRISPR2 在 線軟 件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/） 設(shè) 計gRNA 序列，選擇位于308 bp 至329 bp 之間的序列5’-TGTTGAATTCGATGGAGGATGG-3’為靶標(biāo)序列，人工合成Oligo 二聚體與CRISPR/Ca9 敲除載體[9]進(jìn)行連接。反應(yīng)體系如下：CRISPR/Ca9 載體2.0 μL，Oligo 二 聚 體 1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL， 無 菌 水H2O 補充至 10.0 μL。凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，挑取白斑進(jìn)行菌液PCR 抗性檢測。提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105 中，用于共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定

采用葉盤法[10]轉(zhuǎn)化煙草8306。取農(nóng)桿菌EHA105 菌液侵染葉圓片，在MS 培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48 h 后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS+NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+Hyg 8 mg/L+Cef 500 mg/L) 上 進(jìn)行培養(yǎng)，待芽長至2 cm 時剪下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+NAA 0.10 mg/L+Hyg 8 mg/L） 中 生 根 成苗。提取抗性苗葉片DNA，利用NtCPS2 特異引物（F1:GTTAAATGAAATCATAGCGGAATTG；R1:ACACGTCTTACTT GTGATAATGTT）進(jìn)行PCR擴增，回收擴增產(chǎn)物（萊楓生物試劑盒），由金唯智公司進(jìn)行序列測定。

陽性植株自交收種，漂浮育苗至三葉一心，采用CTAB法提取T1代單株葉片的DNA，利用潮霉素抗性基因特異引 物（F2：CGAGAGCCTGACCTATTG CAT，R2 ：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC）進(jìn)行PCR擴增，對T1代單株進(jìn)行分子鑒定，篩選出無潮霉素抗性基因的單株自交留種，用于田間試驗和性狀分析。

1.2.3 RT-PCR 分析

分別選取8306 和8306-1 的5 cm 長的幼嫩葉片，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以煙草L25 核糖體蛋白（L18908）為內(nèi)參基因，采用半定量PCR 技 術(shù)， 對 NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1、NtGPPS、NtGGPPS、NtCPS2、NtABS、NtCYC 和 NtCYP71D16 等基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。引物序列設(shè)計如下表所示：

表1 擴增引物序列Tab. 1 Amplification of primer sequences

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

8306 及其NtCPS2 基因敲除純合去載體的株系8306-1 進(jìn)行漂浮育苗，于2019 年5 月5 日移栽至河南省農(nóng)科院煙草研究所試驗田。按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進(jìn)行大田管理，并在現(xiàn)蕾期進(jìn)行農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測量[11]。

1.2.5 腺毛形態(tài)學(xué)觀察及密度統(tǒng)計分析

選取長10 cm 左右的幼葉，從葉尖向葉基數(shù)第四脈和第五脈間之間取樣，葉片腺毛組織化學(xué)染色法參考 Lin 和 Wagner 的方法[12]。將葉片在 0.2%（w/v）羅丹明B 水溶液中浸染30 min，用蒸餾水漂洗三次，使用無菌濾紙吸干表面水分后，利用超景深顯微鏡（基恩士VHR-5000，日本）對葉片表面進(jìn)行觀察，并在上表皮中部隨機選擇3 個視野進(jìn)行腺毛形態(tài)拍照和腺毛密度統(tǒng)計分析。

1.2.6 葉面化學(xué)成分分析

取葉齡為60 天的中部煙葉（10～12 葉位）進(jìn)行葉面分泌物的提取。樣品的制備及前處理參考韓錦峰等[13]的葉圓片法。在二氯甲烷溶液中浸提，浸提液加入1 mL 內(nèi)標(biāo)（2.020 mg/mL 的蔗糖八乙酸酯和 2.542 mg/mL 的正十七烷醇的混合溶液）后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后，在氮氣保護(hù)下將溶劑吹干。加入500 μL 1 :1（V : V）DMF : BSTFA，75℃水浴中進(jìn)行衍生化反應(yīng)60 min，然后加入N,O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL。采取GC/MS 分析儀（美國Agilent 公司，色譜儀型號HP-5890，質(zhì)譜儀型號vc-70SE）進(jìn)行樣品化學(xué)成分的定性和定量分析，色譜參數(shù)檢測參考王霄龍等[14]的方法,采用內(nèi)標(biāo)定量法（相對校正因子為1）進(jìn)行定量分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)使用EXCEL 進(jìn)行整理，使用SPSS17.0軟件（IBM，美國）進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)處理采用單因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草8306 NtCPS2 基因突變體的創(chuàng)制和分析

構(gòu)建NtCPS2 敲除載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，并對8306 葉片進(jìn)行侵染，在含有潮霉素（8 mg/L）的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分化。利用NtCPS2 基因特異引物對潮霉素抗性植株進(jìn)行PCR 擴增和產(chǎn)物測序。在所檢測的42 株抗性苗中，有19 株在gRNA 區(qū)域出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，基因編輯效率接近45.2%。其中，編號為C13 的植株在第324 位置插入A，發(fā)生了單堿基插入的純合突變（圖2），致使翻譯提前終止，NtCPS2基因表達(dá)蛋白合成受阻。自交收種后對T1 代進(jìn)行潮霉素基因檢測，篩選NtCPS2 基因發(fā)生純合突變且無轉(zhuǎn)基因元件的株系，自交收種，并命名為8306-1。

圖2 8306NtCPS2 基因敲除植株gRNA 序列分析Fig. 2 gRNA sequencing analysis of 8306 plant with NtCPS2 gene knockout

2.2 NtCPS2 基因突變對煙株農(nóng)藝性狀的影響

為比較NtCPS2 基因敲除對煙株生長發(fā)育的影響，將8306 和8306-1（T2 代）在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗田進(jìn)行種植。田間觀察發(fā)現(xiàn)，在整個生育期中，8306-1 與8306 的生長發(fā)育狀況基本一致（如圖3）。在現(xiàn)蕾期對各項農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，株高、莖圍、節(jié)距、最大葉長、最大葉寬和有效葉數(shù)上，8306-1 和8306 之間并無差異。

2.3 NtCPS2 基因敲除對腺毛發(fā)育的影響觀察

在煙株幼苗期分別對8306 和8306-1 幼葉進(jìn)行葉面腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計，結(jié)果如圖4?？梢钥闯觯?306-1 與對照8306 的葉面腺毛均由長柄分泌型、短柄分泌型和非分泌型3 種類型組成，且均以長柄分泌型為主；長柄腺毛分泌旺盛，其分泌物能被羅丹明染成紅色。對腺毛密度的統(tǒng)計結(jié)果可以看出，8306-1 與對照8306 相比，無論是腺毛總量還是腺毛不同類型，腺毛密度都沒有顯著差異，說明NtCPS2 基因的表達(dá)對煙草腺毛發(fā)生并無影響。

圖3 田間植株形態(tài)觀察Fig. 3 Plant Morphology Observation of 8306 and 8306-1 in Field

表2 8306 和8306-1 農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果Tab. 2 Comparison of agronomic traits between 8306 and 8306-1

圖4 8306 和8306-1 腺毛形態(tài)及腺毛密度Fig. 4 Comparison of trichome morphology and density between 8306 and 8306-1

2.4 NtCPS2 基因突變對煙草葉面化學(xué)成分的影響

對葉齡為60 天的中部葉片進(jìn)行葉面化學(xué)成分萃取和GC/MS 檢測分析，結(jié)果如圖5 所示。從質(zhì)譜圖可以看出，NtCPS2 基因突變對葉面化學(xué)組成成分產(chǎn)生了明顯影響：8306 的主要葉面化學(xué)成分為α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇、順冷杉醇、賴百當(dāng)二醇和蔗糖酯，而8306-1 主要化學(xué)成分為α，β-西柏三烯一醇、α，β-西柏三烯二醇和糖酯，保留時間為42.89 min 的順冷杉醇峰和保留時間為54.23 min的賴百當(dāng)二醇峰明顯缺失，說明其不含賴百當(dāng)類二萜。從含量上看，8306-1 和8306 相比，西柏烷類二萜、蔗糖酯及葉面化學(xué)成分總含量均沒有顯著差異，而賴白當(dāng)類二萜則呈極顯著差異，可見，NtCPS2 基因突變可以有效抑制賴百當(dāng)類二萜的生物合成，對其它葉面化學(xué)成分無明顯影響。

圖5 8306 與8306-1 葉面化學(xué)成分檢測分析Fig. 5 Detection and analysis of leaf surface chemical components between 8306 and 8306-1

2.5 NtCPS2 基因突變對煙草二萜代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為闡明NtCPS2 基因突變對煙草萜類代謝的影響，采用RT-PCR 技術(shù)對二萜代謝及MEP 途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析。從圖6 可以看出，在8306 與8306-1 中，類萜前體物質(zhì)IPP 及DMAPP生物合成的MEP 途徑中的關(guān)鍵酶基因NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtCMK、NtMCS、NtHDS、NtIPI1的表達(dá)水平基本一致，煙草二萜合成關(guān)鍵基因NtCPS2、NtABS、NtCYC、NtCYP71D16 及其上游基因NtGPPS、NtGGPPS 的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上亦無明顯差異。這說明NtCPS2 基因突變并不影響煙草類萜合成相關(guān)基因的表達(dá)，除了賴百當(dāng)化合物合成受阻之外，其它萜類代謝流向穩(wěn)定。這與葉面化學(xué)成分的檢測結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論與討論

煙草二萜化合物在煙草長柄腺毛中特異合成并向葉表面分泌，構(gòu)成了煙草葉面化學(xué)的主要成分。目前已知的煙草二萜化合物主要包括西柏烷和賴百當(dāng)兩大類，二者在不同類型煙草間的分布不同[15]，是其煙葉香氣風(fēng)格特征形成的原因之一?？緹熤卸苹衔镆晕靼赝轭悶橹鳎蠖鄶?shù)主栽品種中不含賴百當(dāng)化合物，但在豫煙11 中檢測到了順冷杉醇和賴百當(dāng)二醇的存在，推測這是導(dǎo)致該品種具有“特香型風(fēng)味”的主要原因[7]。由于豫煙11 是由8306 和K326 雜交而成，而K326 本身不含有賴百當(dāng)二萜，因此對8306 葉面化學(xué)的改良是恢復(fù)豫煙11 典型烤煙風(fēng)格的關(guān)鍵。同時，作為重要的高香氣育種材料，8306 葉面化學(xué)成分的定向改良對高香氣烤煙育種也具有重要意義。

圖6 二萜合成途徑及半定量PCR 分析Fig. 6 Semi-quantitative PCR analysis of terpene synthesis genes between 8306 and 8306-1

NtCPS2 是煙草賴百當(dāng)二萜合成的關(guān)鍵酶基因。Sallaud[8]等研究發(fā)現(xiàn)，烤煙中NtCPS2 基因第4 外顯子的堿基突變導(dǎo)致翻譯提前終止，是烤煙中賴百當(dāng)二萜合成受阻的根本原因。本研究利用CRISPR/ CAS9技術(shù)對NtCPS2 基因進(jìn)行編輯，其純合突變株系8306-1 腺毛發(fā)育正常，但葉面化學(xué)成分中順冷杉醇和賴百當(dāng)二醇明顯缺失，這與Sallaud 等人的研究結(jié)果相符，證明NtCPS2 是調(diào)控?zé)煵葙嚢佼?dāng)二萜生物合成的關(guān)鍵基因?？紤]到西柏烷二萜和賴百當(dāng)二萜具有相同的底物GGPP，賴百當(dāng)合成受阻理論上應(yīng)該會引起西柏烷二萜含量的提高，但本研究結(jié)果顯示8306-1中西柏烷二萜、蔗糖酯含量及葉面化學(xué)總量與對照相比并無顯著變化。這可能是由于烤煙中賴百當(dāng)二萜的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于西柏烷二萜，抑制其合成對西柏烷二萜合成不會造成明顯影響。RT-PCR 分析結(jié)果顯示8306與8306-1 中IPP 及二萜合成相關(guān)基因的表達(dá)水平基本不變，這也證明了NtCPS2 基因突變除了抑制賴百當(dāng)二萜合成之外，對煙草類萜整體代謝流向影響不大，加之NtCPS2 基因突變后煙株生長發(fā)育和農(nóng)藝性狀正常，因此認(rèn)為該基因是進(jìn)行煙草葉面化學(xué)成分定向改良的理想靶點。

煙草8306 是河南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊鐵釗課題組以腺毛分泌物為目標(biāo)選育出的育種材料，在烤煙高香氣育種中發(fā)揮重要作用。通過NtCPS2 基因突變來抑制8306中賴百當(dāng)二萜的生物合成，有利于彰顯典型的烤煙香氣風(fēng)格、擴大其在高香氣烤煙育種中應(yīng)用范圍。另外，在對8306 葉面化學(xué)成分進(jìn)行定向改良的基礎(chǔ)上還可以對其腺毛密度進(jìn)行分子改良，進(jìn)一步提高西柏烷二萜和蔗糖酯等腺毛分泌物的含量，創(chuàng)制高分泌型育種材料，為高香氣烤煙育種奠定基礎(chǔ)。