張 靜，粟建光，唐 蜻，戴志剛，陳小軍，許 英

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類(lèi)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類(lèi)生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

大麻（Cannabis sativaL.）為大麻科大麻屬1 年生草本植物，是重要的藥用和纖維作物，也是現(xiàn)存最古老的作物之一[1]。傳統(tǒng)上，大麻的主要功能是提取韌皮纖維作為紡織原料以及種子榨油食用。近年來(lái)，對(duì)大麻活性成分的大量研究表明，大麻中含有多種生物活性物質(zhì)，部分生物活性物質(zhì)具有較高藥用價(jià)值，如大麻素[2]。目前，研究最多的大麻素為四氫大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD），二者均屬于萜類(lèi)化合物，且互為同分異構(gòu)體[3]，是大麻中含量較高、藥用性能研究較成熟的活性物質(zhì)。THC 有較強(qiáng)的致幻作用和成癮性，過(guò)量攝入會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和身體造成損傷[4]，因此大麻栽培和利用等環(huán)節(jié)均受到嚴(yán)格管控，適合大面積種植的工業(yè)大麻品種要求THC 含量低于0.3%[5]。CBD 是非成癮性大麻素，已有研究證實(shí)，CBD 能夠阻斷某些多酚對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的影響，對(duì)癲癇、癌癥、抑郁癥等精神性疾病具有很好的藥效[6]。工業(yè)大麻中CBD 藥用性能的開(kāi)發(fā)，豐富了醫(yī)學(xué)原料，同時(shí)對(duì)工業(yè)大麻育種提出了新的要求，選育高CBD低THC含量的工業(yè)大麻品種成為大麻育種的首要目標(biāo)[7]。

腺毛主要參與植物的防御反應(yīng)、合成并儲(chǔ)存某些次生代謝物[8]。按有無(wú)分泌功能可將腺毛分為分泌型腺毛和非分泌型腺毛，大麻、黃花蒿、煙草和部分茄科植物等均有分泌型和非分泌型腺毛的相關(guān)研究報(bào)道。非分泌型腺毛是進(jìn)行植物分類(lèi)的一項(xiàng)重要依據(jù)，也是植物抵御某些非生物脅迫和生物脅迫的有力屏障[9?11]；分泌型腺毛被譽(yù)為“植物化工廠(chǎng)”，主要分泌和儲(chǔ)存某些次生代謝物，其分泌物主要包括部分香料作物的香氣物質(zhì)和某些特定的酚類(lèi)、醛類(lèi)等物質(zhì)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，大麻素類(lèi)物質(zhì)一般是在腺毛中合成與積累[13]，大麻素含量與分泌型腺毛相關(guān)。

工業(yè)大麻腺毛單位面積數(shù)量一般表現(xiàn)為雌株比雄株豐富，雌株中又以種子苞片、花、幼葉等部位腺毛最密集。腺毛分泌物與大麻的藥用價(jià)值密切相關(guān)，大麻腺毛的種類(lèi)及密度對(duì)大麻素含量具有較大影響[13]。目前，國(guó)內(nèi)高CBD 含量工業(yè)大麻品種資源匱乏，為推動(dòng)藥用工業(yè)大麻定向選育，培育出高藥用價(jià)值工業(yè)大麻品種，系統(tǒng)闡述了工業(yè)大麻腺毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及3 種分泌型腺毛的特征及特性、腺毛內(nèi)主要次生代謝物質(zhì)合成途徑、大麻素調(diào)控機(jī)制。

1 大麻腺毛的形態(tài)與功能

大麻腺毛觀(guān)察早在20世紀(jì)已經(jīng)開(kāi)展，不同腺毛的形狀、大小差別較大且組成細(xì)胞數(shù)量不同[14]，有分泌型腺毛和非分泌型腺毛之分，大麻雌雄植株均分布有分泌型腺毛和非分泌型腺毛，其中雄性植株分泌型腺毛的數(shù)量和種類(lèi)均明顯少于雌性[15]。筆者通過(guò)Leica 立體顯微鏡觀(guān)察大麻雌株葉片和雌花發(fā)現(xiàn)，雌株葉片及雌花表面腺毛分布較為密集，在顯微鏡下觀(guān)察到的腺毛大部分呈透明狀，由球形的頭部和長(zhǎng)柄組成（圖1），同時(shí)也嘗試用掃描電鏡觀(guān)察生長(zhǎng)中期的大麻葉表皮，發(fā)現(xiàn)大麻葉片表皮腺毛中非分泌型腺毛分布最為廣泛，且密度最高（圖2），推斷葉片表面密布的非分泌型腺毛可能與植物的自我防御有關(guān)。

圖1 雌性工業(yè)大麻葉片（A）和雌花（B）表面腺毛觀(guān)察Fig.1 Glandular hairs on female industrial hemp leaves（A）and female flowers（B）

圖2 大麻葉表皮掃描電鏡觀(guān)察Fig.2 Top view of hemp leaf epidermis by scanning electron microscope

20 世紀(jì)70 年代，研究人員通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，大麻嫩葉和花萼表面存在3 種不同類(lèi)型的分泌型腺毛，分別為頭狀有柄腺毛（Capitate?stalked glandular trichome）、頭狀無(wú)柄腺毛（Capitate?sessile glandular trichome）和球狀腺毛（Bulbous glandular trichome）[3，14]（圖3），且3 種分泌腺毛的分泌細(xì)胞數(shù)量不相同[14，16]，但均有用于儲(chǔ)存和分泌代謝物的分泌腔。

研究者[15]通過(guò)觀(guān)察大麻花萼發(fā)育進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期分泌型腺毛的種類(lèi)和密度不同，推測(cè)此現(xiàn)象可能與植株所處的生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)，其中，有柄腺毛通過(guò)一個(gè)由多細(xì)胞組成的長(zhǎng)柄將球形的分泌腔與植物表面連接（圖3A）；球狀腺毛由球狀的頭部和短柄狀的基座組成（圖3C）[14]，且已有研究結(jié)果顯示，球狀腺毛只能生產(chǎn)有限的特定代謝產(chǎn)物；無(wú)柄腺毛是由一個(gè)直徑50～70 μm 的球形分泌腔直接著生在大麻組織表面[14?15]（圖3B）。研究表明，有柄腺毛的分泌能力最強(qiáng)，分泌的大麻素種類(lèi)最多[13，17]，熒光染色試驗(yàn)[14]同樣證實(shí)，有柄腺毛能合成的大麻素種類(lèi)最多，分泌能力較無(wú)柄腺毛更強(qiáng)，可能與有柄腺毛和無(wú)柄腺毛頭部大小差異有關(guān)[13]。研究者在觀(guān)察大麻苞片表面腺毛發(fā)育進(jìn)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，有柄腺毛較無(wú)柄腺毛和球狀腺毛出現(xiàn)時(shí)期滯后，且隨著植株發(fā)育進(jìn)程不斷推進(jìn)，有柄腺毛占總腺毛比例不斷上升[15]。LIVINGSTON 等[14]推測(cè)，無(wú)柄腺毛可能是有柄腺毛發(fā)育的早期階段，有柄腺毛可能由無(wú)柄腺毛進(jìn)化形成。

圖3 大麻嫩葉和花萼表面3種分泌型腺毛Fig.3 Three types of hemp glandular trichomes on tender leaves and calyces

2 腺毛內(nèi)主要次生代謝物質(zhì)的合成途徑

植物次生代謝物質(zhì)是指通過(guò)植物次生代謝途徑合成的一類(lèi)生物小分子[18]，是植物適應(yīng)環(huán)境和應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的重要防護(hù)屏障，植物次生代謝物主要包括黃酮類(lèi)、萜類(lèi)等。腺毛是植物重要的分泌器官，大量次生代謝物的合成以及儲(chǔ)存在此進(jìn)行，大麻素是大麻腺毛的主要次生代謝物，研究報(bào)道，大麻素主要由大麻分泌型腺毛合成和儲(chǔ)存，大麻素的合成過(guò)程較為復(fù)雜，包括己酸途徑、2-甲基赤蘚醇磷酸（MEP）途徑、焦磷酸香葉酯（GPP）途徑和以這3個(gè)途經(jīng)合成產(chǎn)物為底物的Cannabinoid 途徑4 個(gè)環(huán)節(jié)共同完成[19?22]（圖4）。其中，MEP途徑為大麻素與青蒿素合成中共有的環(huán)節(jié)，也是植物進(jìn)行萜類(lèi)物質(zhì)合成的重要步驟[23]，通過(guò)MEP 途徑合成的異戊烯基二磷酸（IPP）和二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）同為大麻素和青蒿素合成的重要底物之一。大麻素合成過(guò)程中，己酸途徑產(chǎn)物乙酰輔酶A 通過(guò)聚酮合酶（OLS）催化形成戊基二羥基苯酸（OLA），與GPP 途徑產(chǎn)生的GPP 在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化下形成產(chǎn)物大麻萜酚酸（CBGA）[20，24]，這一步驟被認(rèn)為是大麻素合成途徑中最為關(guān)鍵的一步，通過(guò)此次催化反應(yīng)生成大麻素合成途徑中的第一類(lèi)大麻素[25]，也為后續(xù)多種大麻素的合成提供底物。此外，大麻素合成過(guò)程中OLA 也可以和GPP 的異構(gòu)體焦磷酸橙花酯（NPP）同樣通過(guò)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化生成大麻酚酸（CBNRA）[26?27]，但由于CBNRA 合成量較少，此路徑研究報(bào)道較少。CBGA 經(jīng)腺毛中特異性表達(dá)的四氫大麻酚酸合成酶（THCAS）、大麻二酚酸合成酶（CBDAS）、大麻環(huán)萜酚酸合成酶（CBCAS）催化形成四氫大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）、大麻環(huán)萜酚酸（CBCA）[28?29]，最后經(jīng)過(guò)非酶促反應(yīng)脫羧形成THC、CBD和大麻環(huán)萜酚（CBC）[30]。

圖4 大麻素合成途徑Fig.4 The synthesis pathway of cannabinoid

3 大麻素調(diào)控機(jī)制

大麻素是大麻腺毛合成的重要藥用活性物質(zhì)，目前關(guān)于大麻素的研究熱點(diǎn)主要集中在降低精神活性物質(zhì)THC 含量及提高藥用價(jià)值成分CBD 含量方面[7]。CBDA 和THCA 是由共同的前體物質(zhì)CBGA轉(zhuǎn)化而來(lái)，且互為同分異構(gòu)體，調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜[31]，易受環(huán)境和品種本身因素影響。大麻中CBD和THC 含量波動(dòng)較大，但CBD 與THC 比值在作物的生命周期中變化較小，推測(cè)CBD/THC 易受位于同一個(gè)基因座上的2 個(gè)共顯性基因影響，當(dāng)BT基因純合時(shí)以THC的合成為主，當(dāng)BD基因純合時(shí)則主要合成CBD，BD和BT同時(shí)出現(xiàn)則THC和CBD均合成[32]。

陳璇等[20]篩選了16 個(gè)與大麻素合成相關(guān)的基因，通過(guò)熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，4-磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖激酶（CMK）基因、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶（MDS）基因、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶（HDS）基因、4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（HDR）基因、GPP基因的表達(dá)量與大麻素合成量呈正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，在以大麻萜酚酸為底物的下游生物合成過(guò)程中，單一CBDAS 可以催化CBGA 合成CBDA 和少量THCA，同樣，單一THCAS 也可以催化合成少量CBDA[20，33]。

THCAS 與CBDAS 基 因 位 于6 號(hào) 染 色 體[33]，CBDAS/THCAS 相關(guān)的13 個(gè)基因拷貝主要分布在9號(hào) 染 色 體25～33 Mb 的3 段 區(qū) 間 內(nèi)，1 個(gè) 單 拷 貝CBDAS 相關(guān)基因位于30 Mb 區(qū)間，其余基因分別位于25 Mb和29 Mb 2個(gè)串聯(lián)重復(fù)簇內(nèi)，每個(gè)重復(fù)單元由基因序列和兩側(cè)的LTR 序列構(gòu)成[5]。目前，THCAS 基因是大麻素調(diào)控基因中功能研究最深入的基因。1995年，TAURA等[34]發(fā)現(xiàn)，THCAS是74 ku的單體脫氫酶，催化由戊基間苯二酚酸到THCA 的氧化環(huán)化反應(yīng)。2004 年，科學(xué)家成功克隆THCAS基因，進(jìn)一步證明THCAS 基因的功能是調(diào)控CBGA轉(zhuǎn)換為T(mén)HCA[35]。研究發(fā)現(xiàn)，高THC 含量大麻中THCAS基因表達(dá)量量高[36]，而CBDAS基因在工業(yè)大麻中表達(dá)量呈偏高[37]。不同pH 值同樣影響著THCAS及CBDAS 的催化活性，當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，CBDAS 催化能力最強(qiáng)，分泌CBD 含量相對(duì)較高[33]。THCA 和CBDA 的合成是由2 個(gè)堿基序列相似度較高且聯(lián)系較為密切的不同基因控制[38?39]，且THC 和CBD 在不同類(lèi)型大麻中以相似的路徑合成[40]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在2011年第1 個(gè)大麻品種Purple Kush 參考基因組序列發(fā)布后，研究人員發(fā)現(xiàn)，該品種的基因序列中存在1個(gè)THCAS基因和多個(gè)CBDAS基因，由此推測(cè)CBD 合成由多位點(diǎn)控制[41]，然而，其多個(gè)CBDAS 基因能否行使功能尚未完全驗(yàn)證。進(jìn)一步研究大麻品種Finola 基因組和轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，CBDAS基 因 也 能 合 成THC[39，41]。THCAS 和CBDAS 同 為 大麻素合成途徑末端最重要的2 種酶，這2 種酶的催化作用顯著影響大麻重要藥用成分和毒性物質(zhì)含量，調(diào)整THCAS 基因的表達(dá)能夠有效抑制THC 的合成，通過(guò)RNA 干擾THCAS 基因是降低THC 合成量的一個(gè)有效途徑[42]。

4 討論及展望

非分泌型腺毛是植物抵御某些非生物脅迫和生物脅迫的有力屏障，分泌型腺毛是分泌和儲(chǔ)存某些次生代謝物的植物化工廠(chǎng)。據(jù)報(bào)道，植物腺毛生長(zhǎng)除受自身因素影響外，還受光、水、肥、激素等環(huán)境因素影響。不同的光照強(qiáng)度可以改變煙葉表面腺毛的類(lèi)型、密度以及內(nèi)容物含量，影響煙葉的化學(xué)品質(zhì)[43]，也可影響薄荷次生代謝物的分泌[44]；藍(lán)光可誘導(dǎo)茶樹(shù)合成更多次生代謝類(lèi)物質(zhì)[45]。干旱脅迫可改變荊芥表面腺毛數(shù)量及分泌的次生代謝物的種類(lèi)和比例[46]，顯著影響煙草香氣物質(zhì)西柏烷類(lèi)化合物含量[47]。缺少Fe、B、Ca、Mg 等元素都會(huì)對(duì)煙草腺毛的生長(zhǎng)不利[48]，而增施腐植酸類(lèi)有機(jī)肥料能夠顯著提高煙草腺毛密度，提升煙草香氣物質(zhì)合成量[49]。植物激素茉莉酸甲酯能使番茄[50]、向日葵[51]和黃花蒿[52?53]腺毛數(shù)目增加，次生代謝物質(zhì)和防御蛋白含量上升；噴施水楊酸能夠緩解非生物脅迫對(duì)青蒿的影響，同時(shí)刺激其腺毛發(fā)育，提高青蒿素的合成量[54]；噴施赤霉素使煙草葉片表面腺毛密度增加近1/3，進(jìn)而增加腺毛分泌物含量，提升烤煙香氣[55]，也能促進(jìn)番茄表面腺毛生長(zhǎng)[56]。有關(guān)工業(yè)大麻腺毛生長(zhǎng)影響因子的報(bào)道較少，除吳姍[57]報(bào)道激動(dòng)素（KT）影響其代謝物質(zhì)分泌外，光、水、肥及其他激素對(duì)腺毛生長(zhǎng)的影響鮮有研究報(bào)道，因此，今后工業(yè)大麻研究可側(cè)重于深入研究光、水、肥、激素等非生物因素對(duì)工業(yè)大麻腺毛分泌能力的影響。

大麻腺毛的觀(guān)察研究歷時(shí)近50 a，其功能和結(jié)構(gòu)已得到清晰展示，其分泌的重要次生代謝物質(zhì)CBD 及THC 的合成途徑和調(diào)控機(jī)制研究也已有頗多報(bào)道。但是，大麻腺毛分泌的代謝物質(zhì)除CBD 及THC 外還有很多其他物質(zhì)，其中，酚類(lèi)物質(zhì)就有60多種，如大麻酚（CBN）、次大麻二酚（CBDV）及CBC等，這些物質(zhì)大部分具有特殊藥用功效[58]，然而，這些酚類(lèi)物質(zhì)在腺毛中分泌、合成及調(diào)控的途徑研究少見(jiàn)報(bào)道，故更多的大麻腺毛分泌次生代謝產(chǎn)物功能及其調(diào)控機(jī)制尚待挖掘，以有助于工業(yè)大麻藥用物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用。

大麻腺毛中分泌代謝物質(zhì)THC 具較強(qiáng)的致幻作用和成癮性，致使大麻種植一直受限。分子設(shè)計(jì)育種和分子聚合輔助育種是遺傳改良的有效途徑，也是未來(lái)的育種方向。若能采用敲除或者沉默等方法消除與THC 分泌相關(guān)聯(lián)基因的影響，或者通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種和分子聚合輔助育種選育出零THC含量的工業(yè)大麻品種，將促進(jìn)工業(yè)大麻各領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展。然而，目前與工業(yè)大麻腺毛生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝分泌調(diào)控關(guān)聯(lián)基因的報(bào)道較少，研究深度較淺，加上工業(yè)大麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不成熟，關(guān)聯(lián)基因功能尚未得到充分驗(yàn)證。因此，有必要加大與腺毛分泌代謝物質(zhì)關(guān)聯(lián)基因尤其是與THC 關(guān)聯(lián)關(guān)鍵基因的挖掘研究，優(yōu)異等位基因的挖掘及功能驗(yàn)證將為大麻腺毛分泌特性改良、藥用工業(yè)大麻定向選育、低毒甚至無(wú)毒高藥用價(jià)值工業(yè)大麻品種培育奠定基礎(chǔ)。