鄔帥帆，崔秀明，黃艷

華寶香精股份有限公司，上海市葉城路1299號(hào) 201821

煙堿是煙葉中含量最高的生物堿，不但大量以有機(jī)酸鹽的形式存在于煙草植物中，在其他植物中也有發(fā)現(xiàn)。煙堿單體的易揮發(fā)性、易氧化性以及光分解的性質(zhì)限制了其在新型煙草制品中的應(yīng)用[1,2]。由于煙堿的分子結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)氮雜環(huán)構(gòu)成（圖1a），其中吡啶環(huán)的氮原子由于芳香化的影響，堿性較弱，吡咯環(huán)的氮原子的堿性與脂肪族叔胺的堿性相近[3]，20℃ 8.1 g/L 濃度的煙堿水溶液的pH 值大約為10.2 左右，因此將煙堿與酸性化合物結(jié)合制備成復(fù)合物可以很好的解決上述的問題[4-6]。其中煙堿與苯甲酸的復(fù)合物應(yīng)用最為廣泛。苯甲酸是一種芳香族羧酸（圖1b）又稱安息香酸，是煙草制品許可使用的添加劑，其20℃飽和水溶液的pH 值大約為3 左右，因此可以和煙堿以鹽的形式結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但是兩者間的相互作用尚不明確。核磁共振氫譜法、紅外光譜分析、等溫滴定量熱法、Job’s Plot 法以及化學(xué)理論計(jì)算，可以用來剖析煙堿與苯甲酸之間具體的相互作用方式[7,8]。

圖1 （a）煙堿分子結(jié)構(gòu) （b）苯甲酸分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 (a) Molecular structure of nicotine (b) Molecular structure of benzoic acid

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：苯甲酸（分析純）、氘代水（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；煙堿（分析純），購(gòu)于百靈威科技有限公司。

儀 器： Bruker DRX - 400 核 磁 共 振 儀（ 瑞士Bruker 公司）； Nano-ITC 等溫滴定量熱儀（美國(guó)TA 儀器有限公司）； Gaussian 09 軟件； Nicolet iS10 傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）； TGA 8000 型熱重分析儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Job’s Plot 法測(cè)定煙堿與苯甲酸的結(jié)合比例

配置0.02 mol/L 濃度的煙堿氘代水溶液以及0.02 mol/L 濃度的苯甲酸氘代水溶液，分別取適量溶液進(jìn)行混合（見表1），使混合溶液中兩者的摩爾比依次有所增減，但兩者的摩爾濃度之和保持不變，測(cè)定所得混合溶液的核磁氫譜，記錄煙堿甲基氫的核磁位移。

表1 Job’s Plot 法測(cè)定煙堿和苯甲酸的結(jié)合比例Tab. 1 Determination of the binding ratio by Job’s Plot method

1.2.2 紅外光譜分析

煙堿、苯甲酸、煙堿苯甲酸復(fù)合物的紅外光譜數(shù)據(jù)以空氣為背景，采用KBr 壓片法測(cè)量，測(cè)定的頻率范圍為4 000～600 cm-1。

1.2.3 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)

25℃下，將20.3 mmol/L 的煙堿水溶液取50 μL置于注射器中，樣池中加入170 μL 1.406 mmol/L 苯甲酸水溶液。用煙堿溶液滴定苯甲酸溶液，每次滴加3.98 μL，共13 次，每次間隔200 s。

1.2.4 分子建模計(jì)算

在Gaussian 09 軟件中使用B3LYP/6-31G（d，p）方法完成所有的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，頻率、熱力學(xué)性質(zhì)和能量的計(jì)算?；M重疊誤差BSSE 的計(jì)算是用Boys-Bernardi 的CP 方法。

1.2.5 熱重分析

分別稱取5 mg樣品置于熱重分析儀樣品坩堝內(nèi)，控制20℃/min 的升溫速度，在空氣氛圍下從35℃升至400℃，測(cè)量樣品的熱重?cái)?shù)據(jù)。

1.2.6 煙堿苯甲酸復(fù)合物的制備

稱取16.2 g 煙堿于50 mL 三口茄形燒瓶，置于冰浴中攪拌15 min，稱取12.2 g 苯甲酸分批少量加入燒瓶中，控制溫度低于10℃，完成后撤除冰浴，繼續(xù)于室溫?cái)嚢?0 min，苯甲酸逐漸溶解，體系顏色加深呈深棕色。反應(yīng)結(jié)束后，過濾取濾液即得煙堿苯甲酸復(fù)合物28 g，收率98.5%。

2 結(jié)果

2.1 煙堿與苯甲酸的結(jié)合比例

Job’s Plot 法是分析化學(xué)中用于確定兩種物質(zhì)結(jié)合量的一種化學(xué)計(jì)量方法，該方法以Paul Job 命名[9]。方法中保持兩種物質(zhì)總的摩爾濃度恒定不變，但兩者的摩爾分?jǐn)?shù)是變化的。以表1 中所得數(shù)據(jù)繪制Job’s Plot 曲線圖，其中X 軸是苯甲酸的摩爾分?jǐn)?shù)，即X=M苯甲酸/（M苯甲酸+M煙堿），Y 軸是煙堿甲基氫的摩爾化學(xué)位移量Y=Δδ×[M煙堿/（M苯甲酸+M煙堿）]，隨著兩者摩爾分?jǐn)?shù)的此消彼漲，可得兩條斜線，交匯點(diǎn)對(duì)應(yīng)的X 軸數(shù)值即為混合物中苯甲酸的摩爾分?jǐn)?shù)。由圖2 可知，曲線最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)X 軸坐標(biāo)為0.5，即苯甲酸的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5，故煙堿與苯甲酸的結(jié)合比例為1 : 1。

圖2 用以測(cè)定結(jié)合比例的Job’s Plot 曲線圖Fig. 2 the Job’s Plot for determination of binding ratio

2.2 煙堿與苯甲酸相互作用的核磁共振研究

按照煙堿與苯甲酸摩爾比1 : 1 制備煙堿苯甲酸復(fù)合物，取少量用氘代水溶解進(jìn)行核磁氫譜檢測(cè)。與煙堿的核磁氫譜比較可以發(fā)現(xiàn)（圖3），復(fù)合物中煙堿的所有質(zhì)子峰受苯甲酸的影響都向低場(chǎng)遷移，說明兩者間存在明顯的相互作用力。分別計(jì)算煙堿所有質(zhì)子的核磁位移量（表2），發(fā)現(xiàn)吡咯環(huán)上質(zhì)子的位移量明顯大于吡啶環(huán)上質(zhì)子的位移量，并且越靠近氮原子的質(zhì)子的位移量越大，說明苯甲酸主要是與煙堿中的吡咯環(huán)相互作用，吡咯環(huán)氮原子周邊的質(zhì)子由于受到苯甲酸羧基吸電子效應(yīng)的影響，化學(xué)位移向低場(chǎng)遷移較明顯。

表2 煙堿質(zhì)子氫核磁位移量Tab. 2 1H NMR chemical shifts of nicotine

圖3 核磁氫譜中煙堿質(zhì)子氫受苯甲酸作用發(fā)生化學(xué)位移（A：煙堿；B:煙堿苯甲酸1：1 復(fù)合物）Fig. 3 1H NMR chemical shifts of nicotine (A: nicotine; B: 1:1 nicotine-benzoic acid complex)

2.3 煙堿與苯甲酸相互作用的紅外光譜研究

煙堿、苯甲酸以及煙堿苯甲酸復(fù)合物的紅外光譜數(shù)據(jù)如圖4 所示。苯甲酸中O-H 結(jié)構(gòu)單元在2500～3300 cm-1范圍內(nèi)有一系列寬而散的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1420 cm-1及925 cm-1的吸收峰是O-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)和面外搖擺振動(dòng)產(chǎn)生的。然而在相應(yīng)的煙堿苯甲酸復(fù)合物中上述幾個(gè)峰基本消失，說明復(fù)合物中不存在O-H 鍵，而是形成了羧酸負(fù)離子與吡咯季銨正離子間的離子鍵，進(jìn)一步證明了煙堿與苯甲酸之間存在的相互作用力[10]。

2.4 煙堿與苯甲酸的結(jié)合常數(shù)

圖4 煙堿、苯甲酸及煙堿苯甲酸復(fù)合物的紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of nicotine, benzoic acid, and nicotine- benzoic acid complex

圖5 等溫滴定量熱法測(cè)定煙堿與苯甲酸的結(jié)合熱力學(xué)數(shù)據(jù)及結(jié)合常數(shù)Fig. 5 Determination of thermodynamic data and association constant by ITC

采用等溫滴定量熱法（ITC）測(cè)定煙堿與苯甲酸的結(jié)合熱力學(xué)數(shù)據(jù)及結(jié)合常數(shù)，結(jié)果見圖5。圖中上半部分的每個(gè)峰代表單次滴定相同體積的煙堿至苯甲酸溶液產(chǎn)生的熱量，下半部分是煙堿與苯甲酸的結(jié)合非線性擬合圖，根據(jù)擬合曲線得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖中。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，煙堿與苯甲酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=0.995，約等于1，因此兩者的結(jié)合比例為1 : 1，驗(yàn)證了此前Job’s Plot 法得到的結(jié)合比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ΔH= -26.8 KJ/mol 為負(fù)值，表明煙堿與苯甲酸的結(jié)合是放熱的，并且兩者之間的作用力為非共價(jià)鍵作用力。ΔG 的負(fù)值證實(shí)了反應(yīng)的自發(fā)性，負(fù)ΔH 和正ΔS表明在兩者結(jié)合過程中存在疏水作用和靜電作用。煙堿與苯甲酸的結(jié)合常數(shù)Ka=9.021×105M-1，解離常數(shù)Kd=1.109×10-6M。

2.5 煙堿與苯甲酸結(jié)合能的分子建模計(jì)算

煙堿與苯甲酸的結(jié)合能可以通過公式：E=ENB-（EN+EB）計(jì)算。其中，E 為煙堿與苯甲酸的結(jié)合能，ENB 為煙堿苯甲酸復(fù)合物的能量，EN、EB 為煙堿，苯甲酸單體的能量。在Gaussian 09 軟件中使用B3LYP/6-31G（d, p）方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，頻率、熱力學(xué)性質(zhì)和能量的計(jì)算，見圖6。通常情況下，基組重疊誤差BSSE 都會(huì)過高的估算相互作用能，所以進(jìn)行零點(diǎn)能校正非常重要，BSSE 的計(jì)算是用Boys-Bernardi 的CP 方法。由計(jì)算所得原始結(jié)合能為-21.86 Kcal/mol，經(jīng)校正后的結(jié)合能為-18.64 Kcal/mol。

2.6 熱重分析

采用熱重分析比較煙堿苯甲酸復(fù)合物與游離態(tài)煙堿熱失重過程的差異。從圖中可以看出煙堿的主要熱失重溫度為80℃至180℃之間，在180℃之后煙堿基本揮發(fā)完全，熱失重曲線趨于平緩，在實(shí)驗(yàn)條件下煙堿的失重率為98.31%，最大失重速率溫度為175℃。煙堿與苯甲酸結(jié)合以后復(fù)合物的失重溫度要比煙堿高不少，復(fù)合物在110℃至230℃之間表現(xiàn)出了一個(gè)急劇失重的過程，在230℃之后由于基本揮發(fā)完全所以熱失重曲線趨于平緩，總的失重率為95.87%，比煙堿低一些，最大失重速率溫度為220℃。

圖6 B3LYP/6-31G（d, p）優(yōu)化的煙堿苯甲酸復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 B3LYP/6-31G(d, p) geometry-optimized structure of nicotineenzoic acid complex

圖7 煙堿及煙堿苯甲酸復(fù)合物的TG，DTG 曲線圖Fig. 7 TG and DTG curves of nicotine and nicotineenzoic acid complex

3 討論

煙堿的分子結(jié)構(gòu)及其pH 特性決定了其可以與無機(jī)酸或有機(jī)酸結(jié)合形成各種復(fù)合物，然而兩者間的結(jié)合比例是不一樣的，比如煙堿與硅鎢酸可以結(jié)合成1 : 1的復(fù)合物，而煙堿與酒石酸的結(jié)合比例為1 : 2，更有甚者可以通過氫鍵的形式結(jié)合第三個(gè)酸分子（例如：煙堿與乙酸）[11]。本文通過Job’s Plot 法及等溫滴定量熱法精確的測(cè)定了煙堿與苯甲酸之間的結(jié)合比例為1 : 1，為其在新型煙草制品中的應(yīng)用明確了比例的基礎(chǔ)。在明確結(jié)合比例的基礎(chǔ)上，通過核磁共振氫譜、紅外光譜研究確定了苯甲酸是與煙堿中吡咯環(huán)形成酸堿作用，這與吡咯環(huán)堿性較強(qiáng)而吡啶環(huán)堿性較弱的理論依據(jù)是一致的。而兩者結(jié)合中的熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明結(jié)合過程是自發(fā)的放熱過程，這也與酸堿結(jié)合的特性相一致。從熱重分析的結(jié)果可以看出，煙堿與苯甲酸的復(fù)合物擁有更高的熱解溫度，這也進(jìn)一步間接的證明了煙堿與苯甲酸之間存在相互的作用力[12]。

4 結(jié)論

通過Job’s Plot 法測(cè)定了煙堿與苯甲酸的結(jié)合比例為1 : 1，進(jìn)一步通過核磁共振氫譜、紅外光譜確定了煙堿與苯甲酸之間存在相互作用力，并且苯甲酸主要與煙堿中的吡咯環(huán)相結(jié)合。通過等溫滴定量熱法再次驗(yàn)證了煙堿與苯甲酸1 : 1 的結(jié)合比例，兩者的結(jié)合是自發(fā)的放熱過程，其中存在靜電作用和疏水作用，通過數(shù)據(jù)擬合得出兩者間的結(jié)合常數(shù)Ka=9.021×105M-1。通過理論計(jì)算得出兩者的修正結(jié)合能E= -18.64 Kcal/mol，熱重分析表明煙堿苯甲酸復(fù)合物有更高的熱解溫度。

致謝：本文中分子建模計(jì)算得到了華東理工大學(xué)馬驤教授課題組的大力支持。