肖勇 夏正新 方玉明

膿毒血癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，死亡率約為30%～70%，是ICU患者死亡的主要原因[1，2]。其中炎性反應(yīng) 、免疫及感染等因素均參與膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制，近年研究提示機(jī)體促炎-抗促炎反應(yīng)平衡穩(wěn)態(tài)的失調(diào)在其中發(fā)揮重要作用[3，4]。越來越多的證據(jù)表明，免疫抑制和功能受損在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用[5]。相比炎性反應(yīng)的早期，超過80%的膿毒癥患者死于免疫狀態(tài)低下的感染[6]。以上研究均提示免疫抑制狀態(tài)是膿毒癥患者預(yù)后不良的重要因素之一。臨床醫(yī)師以患者病情程度作為治療膿毒血癥的基礎(chǔ)，所以需根據(jù)急性生理和慢性健康評(píng)分系統(tǒng)（acute physiologyand chronic health evaluation-II，APACHE-II）判斷患者的病情程度，但APACHE-II需要一定時(shí)間，無法實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)膿毒血癥患者的病情[7]。本項(xiàng)目通過檢測(cè)膿毒血癥患者血液中炎性指標(biāo)（PCT、CRP、 IL-6、IL-10、WBC、NE-UT）及免疫指標(biāo)（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）的變化，旨在闡明上述指標(biāo)對(duì)患者病情程度的預(yù)測(cè)價(jià)值。

對(duì)象與方法

1 對(duì)象 根據(jù)2003年國(guó)際膿毒血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)招募患者[8]，挑選2015年9月～2017年2月本院重癥監(jiān)護(hù)病房住院的膿毒血癥患者54例為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：排除腫瘤、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、糖尿病等影響免疫功能的疾病及過敏體質(zhì)者；年齡為18～80歲。其中女24例，男30例；年齡44～75歲，平均（51.6±4.7）歲；其中包括重癥肺炎29例，其他類型感染25例。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，按照入院時(shí)病情將全部膿毒血癥患者分為膿毒性休克組（n=17）、嚴(yán)重膿毒血癥組（n=19）、膿毒血癥組（n=18）。各組的年齡及性別等一般資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 主要儀器與試劑：人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物工程有限公司。ELISA 試劑盒（IL-6、IL-10）均購(gòu)自美國(guó)美國(guó)R＆D 公司，熒光素FITC 標(biāo)記抗人CD4 /CD8抗體購(gòu)自eBioscience 公司。

2.2 收集標(biāo)本及指標(biāo)檢測(cè)：患者入院第1天7∶00～8∶00，抗凝管留取空腹靜脈血5 mL，首先取3 mL血樣于離心管，放于離心機(jī)，調(diào)轉(zhuǎn)速 3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，-20℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集余下的2 mL血樣，加入熒光素FITC標(biāo)記抗人CD4/CD8抗體，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例的變化。其余血標(biāo)本送往院檢驗(yàn)科。采用電化學(xué)發(fā)光法對(duì)血PCT進(jìn)行檢測(cè)，由羅氏公司和德國(guó)柏林B.R.A.H.M.S Diagnostica公司提供試劑盒和儀器。采用全自動(dòng)生化分析儀（雅培Aeroset）檢測(cè)CRP水平，試劑盒由寧波德賽生物科技有限公司提供。采用希斯美康血細(xì)胞分析儀檢測(cè)NEUT水平，原裝配套試劑，校準(zhǔn)液，質(zhì)控液。所有參入者均簽署知情同意書?；颊呷朐?4 h內(nèi)進(jìn)行APACHE-II評(píng)分，包括年齡、急性生理學(xué)及慢性健康評(píng)分，分?jǐn)?shù)為0～71分，分?jǐn)?shù)高低表示患者病情程度，分?jǐn)?shù)越高越嚴(yán)重。

2.3 檢測(cè)外周血清細(xì)胞因子采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 檢測(cè)：上述收集的血清樣本，按照試劑盒說明書，分別將50 μL樣本及標(biāo)準(zhǔn)品依次加入已包被反應(yīng)孔中，然后將50 μL酶聯(lián)親和物依次加入每孔，37℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體; 用洗滌液反復(fù)沖洗5次，加入底物液顯色，37℃下避光反應(yīng)10～30 min，加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀在450 nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)定吸光度（ A） 值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IL-6和IL-10的水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，細(xì)胞及炎癥因子與NIHSS得分的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各亞組APACHE-Ⅱ評(píng)分比較 患者入院24 h 內(nèi)進(jìn)行APACHE-Ⅱ評(píng)分，膿毒血癥組評(píng)分為（13.87±1.82），嚴(yán)重膿毒血癥組評(píng)分為（21.82±1.78），膿毒性休克組評(píng)分為（28.33±2.05）分，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.29，P＜0.000 1）。見圖1。

2 各亞組膿毒血癥患者炎性指標(biāo)水平 患者入院第1天，將各亞組血液中炎性指標(biāo)NEUT、CRP、PCT、IL-6、IL-10、WBC表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示膿毒血癥組、嚴(yán)重膿毒血癥組、膿毒性休克組表達(dá)水平依次升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

3 各亞組膿毒血癥患者細(xì)胞免疫功能比較 采用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)各亞組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞及CD4+/CD8+比例，結(jié)果提示膿毒血癥組、嚴(yán)重膿毒血癥組、膿毒性休克組T細(xì)胞亞群依次下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

4 膿毒血癥患者APACHE-Ⅱ評(píng)分與體內(nèi)炎性指標(biāo)及免疫功能的相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，膿毒血癥患者體內(nèi)炎癥指標(biāo)（CRP 、PCT、IL-6、IL-10、WBC）與APACHE-Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.778，0.654，0.685，0.541，0.532，P＜0.05），而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與APACHE-Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.676，-0.517，-0.612，P＜0.05）。見表1。

討 論

表1 膿液血癥患者血液中炎性指標(biāo)及免疫功能與APACHE-Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性分析

目前對(duì)膿毒血癥的研究已取得了很大的進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制尚未明確，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子的表達(dá)水平在膿毒血癥的發(fā)病及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尤其是炎癥介質(zhì)可能導(dǎo)致患者體內(nèi)炎性反應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間處于高水平狀態(tài)。研究者Bone等[10]最先提出假說-代償性抗炎反應(yīng)綜合征，提示膿毒血癥患者機(jī)體發(fā)生了促炎與抗炎機(jī)制失調(diào)。而機(jī)體免疫功能變化在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，免疫調(diào)理治療可能是膿毒癥及膿毒癥休克患者的重要治療方法[11]。目前膿毒癥休克仍然具有較高的病死率，是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種生物標(biāo)志物在膿毒癥的病情和預(yù)后及療效評(píng)估等方面發(fā)揮重要作用[12，13]。因單獨(dú)檢測(cè)一種生物標(biāo)志物可能存在敏感性及特異性不高等缺點(diǎn)，可能需要聯(lián)合檢測(cè)多種標(biāo)志物來提高對(duì)膿毒癥患者病情及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。本研究通過檢測(cè)膿毒血癥患者血液中炎性指標(biāo)（PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC、NEUT）及免疫指標(biāo)（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）的變化，旨在明確上述指標(biāo)對(duì)對(duì)患者病情的預(yù)測(cè)價(jià)值。

膿毒血癥發(fā)病不同階段，炎癥介質(zhì)種類及表達(dá)水平有所不同，在膿毒血癥早期機(jī)體呈現(xiàn)以白介素-6（IL-6）為代表的促炎癥介質(zhì)表達(dá)水平的增加，作為對(duì)抗保護(hù)機(jī)制，機(jī)體隨后啟動(dòng)抗炎反應(yīng)，以白介素-10（IL-10）為代表，對(duì)抗促炎癥介質(zhì)的作用，從而降低失控性爆發(fā)性炎性反應(yīng)，以此來減少對(duì)組織的損傷[15]。這是機(jī)體自我保護(hù)，但過度的抗炎反應(yīng)也可導(dǎo)致免疫功能低下，從而減弱對(duì)病原菌的清除，甚至誘導(dǎo)機(jī)體呈現(xiàn)“免疫麻痹”狀態(tài)，由此極大增加患者二次感染的風(fēng)險(xiǎn)[16，17]，現(xiàn)已明確膿毒癥患者存在T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)低下[18]。C 反應(yīng)蛋白CRP是肝細(xì)胞在IL-6 作用下產(chǎn)生的急性時(shí)相蛋白，健康人血清CRP濃度很低（＜5 mg /L），但組織損傷、細(xì)菌感染或應(yīng)激時(shí)其水平明顯升高，且在炎癥早期即顯著升高，是早期反映細(xì)菌感染較敏感的指標(biāo)。PCT 是一種能夠反映感染程度的特異性蛋白質(zhì)，健康人血清濃度一般低于0.1 μg/L，PCT并不直接誘發(fā)膿毒血癥的發(fā)生，但能夠?qū)е虏±砩淼募又豙19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著膿毒血癥患者病情加重，血液中CRP 、PCT、IL-6、IL-10、WBC、NEUT 炎癥指標(biāo)水平依次升高（P＜0.05），而CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞及CD4+/CD8+水平依次降低。其中炎癥指標(biāo)PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC與APACHE-Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.778，0.654，0.685，0.541，0.532，P＜0.05），而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與APACHE-Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.676，-0.517，-0.612，P＜0.05）。提示上述炎性指標(biāo)水平越高，患者病情越嚴(yán)重；并且隨著病情的加重，患者存在嚴(yán)重的免疫功能抑制，隨之導(dǎo)致免疫麻痹狀態(tài)。

綜上所述，膿毒血癥患者存在促炎/抗炎平衡及免疫功能抑制，隨著病情的加重，患者血液中PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC水平呈高表達(dá)，而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈低表達(dá)，故在膿毒血癥的臨床診治過程中，臨床醫(yī)師應(yīng)加強(qiáng)對(duì)炎性介質(zhì)及免疫功能聯(lián)合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這樣將有助于指導(dǎo)患者的臨床治療和評(píng)判預(yù)后。