張晶，陳悅，余偲，張寶善,2*

1(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710119)2(陜西省果蔬深加工工程技術研究中心，陜西 西安，710119)

乳酸菌是一類能夠通過發(fā)酵糖類產生乳酸的細菌總稱[1]。具有維持腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道有害菌的生長繁殖等益生功能[2]；同時調節(jié)消化免疫系統(tǒng)，延緩機體衰老。蘋果營養(yǎng)價值高，生態(tài)適應性強，耐貯性好，供應周期長，世界上相當多的國家都將其列為主要消費果品。中國是蘋果種植大國，產量占世界的40%以上，我國蘋果總產量居其他水果之首，占水果總產量的27%[3]。蘋果含有VC、VE和β-胡蘿卜素等多種維生素類成分以及人體必需的微量元素如鈣、鐵、鉀、錳、鋅、鎂、銅、硫等[4]，同時蘋果中含有17種氨基酸，其中7種為人體必需但自身又無法合成的氨基酸。蘋果中含有鞣質和多種果酸，幫助食物消化，并促進胃收斂，加速食物的消化吸收[5]。長期以來，由于加工條件等的限制，導致了我國大量的蘋果資源浪費，造成了經(jīng)濟損失。

近年來，采用益生菌發(fā)酵果蔬生產的果蔬汁飲料受到許多消費者的青睞，許多國內外學者也致力于益生菌發(fā)酵果蔬汁的研究。利用乳酸菌混合發(fā)酵香梨-黃瓜果蔬汁[6]；利用干酪乳桿菌和植物乳桿菌復合發(fā)酵出營養(yǎng)價值高、風味濃郁藍莓發(fā)酵飲料[7]；對胡蘿卜汁乳酸發(fā)酵技術進行了研究[8]；以柚子和菊芋為原料研制果蔬汁發(fā)酵飲料[9]；葉盼[10]對植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁的生理活性進行研究；嚴成[11]以鮮乳為原料，添加番茄汁、草莓汁、橙汁得到復合果蔬汁進行乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵所得果蔬汁口感細膩，酸甜適中，具有果蔬特有的滋味和芳香。成曉霞等[12]將胡蘿卜原汁分別與草莓汁、桃汁、菠蘿汁等進行了按適當比例混合，制成胡蘿卜混合汁，風味獨特。以蘋果為原料，通過乳酸菌發(fā)酵，不僅能夠高效利用蘋果資源，解決因各種原因導致的蘋果資源浪費現(xiàn)象，還能夠研制出一款兼具蘋果風味和乳酸發(fā)酵風味的蘋果汁發(fā)酵飲料，滿足人們日益增長的消費需求[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

紅富士蘋果采摘于洛川，成熟度好，大小均一，無機械損害，無腐爛或病害。

1.1.2 發(fā)酵菌種

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)YM13011，于陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、吐溫80、K2HPO4、乙酸鈉、MnSO4、MgSO4、檸檬酸三銨、瓊脂粉、蔗糖、抗壞血酸、果膠酶等，所有試劑均為國產分析純，西安博晶生物科技有限公司。酒石酸，蘋果酸，乳酸，乙酸，琥珀酸，檸檬酸，富馬酸，己二酸(均為標準品)，美國 Sigma 公司；甲醇，磷酸均為色譜純。

1.2 儀器與設備

Ultimate3000高效液相色譜儀，Thermo公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，上海躍進醫(yī)療器械廠；SZCL磁力攪拌器，鞏義市宇翔儀器有限公司；BDW1-FW-200高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；HWS智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；LX-B75 L滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 短乳桿菌的活化與擴大培養(yǎng)

菌種的活化：將冷凍保藏的短乳桿菌菌種解凍至室溫，接種至10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、靜置培養(yǎng)24 h。反復活化2～3次，備用。

菌種的馴化：將活化好的短乳桿菌菌種按接種量10%分別接種于50 mL的蘋果汁原汁中，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.3.2 蘋果汁發(fā)酵

蘋果挑選、去核、清洗，切成塊狀后迅速用榨汁機榨汁，將果汁和果渣混合形成果漿，加入3‰的抗壞血酸進行護色處理，然后用電磁爐將果漿加熱至90 ℃左右進行滅菌處理3～5 min，當果漿冷卻至50 ℃左右時，加入適量的果膠酶，攪拌均勻后，放入50 ℃的水浴鍋中酶解3 h，使果肉組織細胞中的果汁充分流出；用離心機分離果汁，巴氏殺菌法進行殺菌獲得澄清的蘋果原汁。

1.3.3 發(fā)酵蘋果汁培養(yǎng)基

選擇短乳桿菌菌株進行發(fā)酵，選取菌濃度為考察指標，經(jīng)單因素試驗篩選出最優(yōu)碳源、氮源和緩沖鹽等因素及其最適濃度。

1.3.3.1 培養(yǎng)基碳源的篩選

不同碳源對LB菌株生長的影響：向含有3 g/L K2HPO4、8 g/L蛋白胨的蘋果汁中分別加入30 g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖以及水蘇糖，121 ℃滅菌20 min，待蘋果汁冷卻至30 ℃時，于無菌操作臺中，接入5%的LB菌株，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，測OD600。

葡萄糖濃度對LB菌株生長的影響：向含有3 g/L K2HPO4、8 g/L蛋白胨的蘋果汁中分別加入10、30、50、70、90 g/L葡萄糖，試驗操作同上，研究葡萄糖濃度對LB菌株生長的影響。

1.3.3.2 培養(yǎng)基氮源的篩選

不同氮源對LB菌株生長的影響：向含有3 g/L K2HPO4、50 g/L葡萄糖的蘋果汁中分別加入8 g/L蛋白胨、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl，121 ℃滅菌20 min，待蘋果汁冷卻至30 ℃時，于無菌操作臺中，接入5%的LB菌株，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，測OD600。

蛋白胨濃度對LB菌株生長的影響：向含有3 g/L K2HPO4、50 g/L葡萄糖的蘋果汁中分別加入5、7、9、11、13 g/L的蛋白胨，試驗操作同上，研究蛋白胨濃度對LB菌株生長的影響。

1.3.3.3 培養(yǎng)基緩沖鹽的篩選

不同緩沖鹽對LB菌株生長的影響:向含有9 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖的蘋果汁中分別加入3 g/L的CaCO3、K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4，121 ℃滅菌20 min，待蘋果汁冷卻至30oC時，于無菌操作臺中，接入5%的LB菌株，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，測OD600，測定菌株濃度。

K2HPO4濃度對LB菌株生長的影響:向含有9 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖的蘋果汁中分別加入1、2、3、4、5 g/L的K2HPO4，試驗操作同上，研究K2HPO4濃度對LB菌株生長的影響。

1.3.4 發(fā)酵蘋果汁工藝的優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

選取總酸、還原糖為考察指標，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間中某一個為單因素變量，其他因素為固定因素進行試驗。具體條件如下：

(1)接種量：設定發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為4 d，菌株接種量分別設定為4%、6%、8%、10%、12%。

(2)發(fā)酵溫度：設定接種量為8%，發(fā)酵時間為4 d，發(fā)酵溫度分別設定為30、33、36、39、42 ℃。

(3)發(fā)酵時間：設定接種量為8%，發(fā)酵溫度為36 ℃，每隔1 d測定1次。

1.3.4.2 蘋果汁乳酸發(fā)酵響應面優(yōu)化

在上述單因素試驗的基礎上，應用中心組合設計Box-Benhnken對蘋果汁發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。選取具有顯著性影響的接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)和發(fā)酵時間(C)3個因素，進行響應面分析，因素水平編碼表見表1。

1.3.5 有機酸的測定

HPLC法測發(fā)酵蘋果汁中各種有機酸含量的變化。色譜條件:DiamonsilC18柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，紫外檢測波長210 nm。流動相的配置:0.01 mol/L (NH4)3PO4，用H3PO4調pH值至2.70，等度洗脫20 min。流速0.7 mL/min，樣品過0.45 μm有機系濾膜。

表1 因素水平編碼表

1.3.6 測定方法

總酸的測定按GB/T 12456—2008[14]執(zhí)行，酸堿滴定法測定(以乳酸計);還原糖的測定：按GB 5009.7—2016[15]執(zhí)行;有機酸的測定：參照GB5009.157—2016[16-17]等的方法并略作改進。

2 結果與分析

2.1 短乳桿菌發(fā)酵蘋果汁培養(yǎng)基

2.1.1 碳源對短乳桿菌菌株生長的影響

由圖1可知，蘋果汁中添加不同碳源對LB菌株生長的影響程度不同，葡萄糖為最適碳源，其次為水蘇糖和果糖，因此在蘋果汁發(fā)酵液中添加葡萄糖作為其碳源補充劑。

由圖2可知，蘋果汁中不同葡萄糖濃度對LB菌株的影響情況也呈現(xiàn)差異性，當葡萄糖質量濃度為50 g/L時，LB菌株的OD600最高，繼續(xù)添加葡萄糖濃度時，OD600下降，因此確定在蘋果汁培養(yǎng)液中的葡萄糖質量濃度為50 g/L。

圖1 不同碳源對菌株生長的影響

圖2 葡萄糖濃度對菌株生長的影響

2.1.2 氮源對短乳桿菌菌株生長的影響

由圖3可知，對蘋果汁中不同氮源LB菌株生長的影響程度不同，蛋白胨為最適氮源，其次為氯化銨和胰蛋白胨，因此在蘋果汁發(fā)酵液中添加蛋白胨作為其氮源補充劑。

由圖4可知，蘋果汁中不同蛋白胨質量濃度對LB菌株的影響情況也呈現(xiàn)差異性，當?shù)鞍纂速|量濃度為9 g/L時，LB菌株的OD600最高，繼續(xù)添加蛋白胨濃度時，OD600下降，因此確定在蘋果汁培養(yǎng)液中的蛋白胨質量濃度為9 g/L。

圖3 不同氮源對菌株生長的影響

圖4 蛋白胨濃度對菌株生長的影響

2.1.3 緩沖鹽對短乳桿菌菌株生長的影響

由圖5可知，蘋果汁中不同緩沖鹽對LB菌株生長的影響程度不同，KH2PO4為最適緩沖鹽，其次為K2HPO4和CaCO3，因此在蘋果汁發(fā)酵液中添加KH2PO4作為其緩沖鹽補充劑。

由圖6可知，蘋果汁中不同KH2PO4濃度對LB菌株的影響情況也呈現(xiàn)差異性，當KH2PO4質量濃度為4 g/L時，LB菌株的OD600最高，繼續(xù)添加KH2PO4濃度時，OD600下降，因此確定在蘋果汁培養(yǎng)液中的KH2PO4濃度為4 g/L。

圖5 不同緩沖鹽對菌株生長的影響

圖6 K2HPO4質量濃度對菌株生長影響

2.2 短乳桿菌發(fā)酵蘋果汁工藝的優(yōu)化

2.2.1 接種量對蘋果汁乳酸發(fā)酵總酸和還原糖含量的影響

由圖7和圖8可知，隨著蘋果汁發(fā)酵時間的延長，蘋果汁的總酸含量先迅速上升，后逐步趨于平緩。接種量由4%增大到8%，總酸含量顯著增加；從整體來看，還原糖含量呈現(xiàn)先持續(xù)下降，后趨于平穩(wěn)的趨勢。當接種量達到8%時，產酸效果最好，此時還原糖含量也最低；而再增加接種量至12%，總酸與還原糖含量無明顯變化。這可能因為當增大接種量，乳酸菌數(shù)目急劇增多，乳酸菌消耗糖速率加快，產酸量增加[18]，但是，由于發(fā)酵蘋果汁中的糖含量有限，當菌種數(shù)量過多時，生長和繁殖速度會減緩甚至下降，所以選取混合菌種的最佳接種量為8%。

圖7 接種量對總酸含量的影響

圖8 接種量對還原糖含量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度對蘋果汁乳酸發(fā)酵總酸和還原糖含量的影響

由圖9和圖10可知，溫度不同，乳酸菌的產酸能力也略有不同。在33 ℃條件下，乳酸菌的產酸較少，在36 ℃條件下，乳酸菌的產酸能力最好，35、40 ℃總酸含量低于36 ℃條件下。這種現(xiàn)象主要是基于不同的溫度梯度，不同的乳酸菌生長的最適溫度是不同的，短乳桿菌的最適生長溫度為35～39 ℃，因此越靠近這個溫度其產酸效果越好。只有菌種處在最適溫度時其發(fā)酵產酸效果才能達到最好[19]。當發(fā)酵溫度較低時，菌生長和繁殖速度較慢，溫度過高對蘋果汁的風味和口感也會有所影響。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為36 ℃。

圖9 發(fā)酵溫度對總酸含量的影響

圖10 發(fā)酵溫度對還原糖含量的影響

2.2.3 發(fā)酵時間對蘋果汁乳酸發(fā)酵總酸和還原糖含量的影響

由圖10和圖11可知，發(fā)酵液中的總酸含量隨發(fā)酵時間先遞增后逐步趨于平穩(wěn)，還原糖含量先下降后逐漸穩(wěn)定。在6 d后總酸含量基本不變，同時還原糖含量下降趨勢不明顯?？赡苁且驗榘l(fā)酵時間的延長，乳酸菌發(fā)酵蘋果汁中的碳水化合物越來越充分，產酸增加[20]；同時發(fā)酵前期菌種繁殖量大，發(fā)酵產酸效果良好，發(fā)酵后期菌種老化，代謝能力減弱，所以選取最適發(fā)酵時間為6 d。

圖11 發(fā)酵時間對總酸含量的影響

圖12 發(fā)酵時間對還原糖含量的影響

2.2.4 響應面回歸模型的建立與分析

設計BBD響應面試驗，以接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為3個響應面變量，總酸含量為響應值進行試驗(表2)。每組試驗測定3次，取平均值。得到回歸方程為Y=-12.66+0.836A+0.435B+1.318 8C-0.016 1AB-0.025 7BC-0.017 5AC-0.006 6A2-0.002 7B2-0.040 7C2。

表2 響應面試驗設計與結果

在此最佳條件下，總酸含量的理論值為2.632 g/100g。為進一步驗證響應面分析結果的可靠性，對最優(yōu)條件進行實際調整，在接種量為8%、發(fā)酵溫度為36 ℃、發(fā)酵時間為6 d的條件下進行3次平行試驗。得到提取效果的實測平均值為2.613 g/100g，與預測值僅相差0.72%。因此響應面優(yōu)化得到的短乳桿菌發(fā)酵蘋果汁的參數(shù)準確可靠，為準確分析蘋果汁中總酸含量提供理論依據(jù)。

表3 響應面試驗方差分析

2.3 蘋果汁乳酸發(fā)酵前后總酸、還原糖、乳酸菌數(shù)的變化

將短乳桿菌按8%的接種量接入殺菌后的蘋果汁中，在36 ℃下發(fā)酵6 d，測定發(fā)酵前后總酸、還原糖和乳酸菌數(shù)，結果見表4。

表4 發(fā)酵前與發(fā)酵后總酸、還原糖、乳酸菌數(shù)的變化

注:表中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

由表看出，蘋果汁發(fā)酵前后相比，總酸含量顯著提高(P<0.05)，增加了2.029 g/100g，達到了2.543 4 g/100g；還原糖含量顯著降低(P<0.05)，減少了7.605 4 g/100g；乳酸菌數(shù)由初始的0.72×109CFU/g達到了1.84×109CFU/g，顯著增加(P<0.05)。

2.4 蘋果汁發(fā)酵前后有機酸含量的變化

有機酸混合標準品的分離圖譜如圖13所示。由表5可知，所測的8種有機酸的R2>0.99，說明相關性好，擬合置信度高。

1-酒石酸;2-蘋果酸;3-乳酸;4-乙酸;5-奎寧酸; 6-琥珀酸;7-富馬酸;8-草酸

表5 不同有機酸的標準曲線

將短乳桿菌按8%的接種量接入優(yōu)化后的蘋果汁發(fā)酵基質中，在36 ℃下發(fā)酵，2 d后測有機酸組成及含量，之后每隔24 h測定，結果見表6。

果汁中的有機酸，對果汁的感官特性、營養(yǎng)品質有重要影響[21]。利用HPLC法對蘋果汁發(fā)酵過程中的8種有機酸進行分析，蘋果酸是蘋果汁在乳酸發(fā)酵過程中含量最高的一種有機酸，發(fā)酵液中除蘋果酸外，還有草酸、奎寧酸等副產物[22]。如表6所示，蘋果汁中蘋果酸的起始濃度為2.918 g/L，在72 h后蘋果酸的含量達到了最大值5.445 g/L，之后又迅速下降，因為在蘋果汁在乳酸發(fā)酵期間進行了三羧酸循環(huán)，蘋果酸作為三羧酸循環(huán)的中間體，其含量隨參與的生化反應進行動態(tài)變化。奎寧酸在蘋果汁中的含量僅次于蘋果酸，發(fā)酵后含量顯著升高[23]，在發(fā)酵開始時，奎寧酸的含量為0.203 9 g/L，隨發(fā)酵時間增加，在72 h間奎寧酸的含量急劇增多，之后增加趨勢平緩，于發(fā)酵結束達到其最大質量濃度0.737 1 g/L。乳酸也是蘋果汁發(fā)酵過程中重要的有機酸，在發(fā)酵初期，乳酸的含量增加不大，但是在發(fā)酵后期，隨著蘋果汁中的葡萄糖經(jīng)糖降解變成丙酮酸，在乳酸脫氫酶的作用下丙酮酸被還原成為乳酸，導致乳酸含量不斷增加[24]，在發(fā)酵結束后達到最大質量濃度0.187 5 g/L，這與ELLENDERSEN等[25]利用干酪乳桿菌發(fā)酵蘋果汁過程中乳酸的變化趨勢相似。乙酸在發(fā)酵過程中含量顯著上升，至發(fā)酵結束濃度達到最大值0.326 5 g/L，因為在蘋果酸—乳酸發(fā)酵過程中，在厭氧條件下，所有的乳酸菌都能代謝丙酮酸而產生乙酸等產物。酒石酸在發(fā)酵72 h時達最高值，之后呈下降趨勢，酒石酸能夠被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸，使揮發(fā)酸含量增加[26]。發(fā)酵結束較發(fā)酵前含量升高0.004 3 g/L。琥珀酸一方面可通過酒石酸分解而生成，但生成量較少，另一方面在蘋果酸-乳酸途徑中，可通過部分丙酮酸氧化為乙酸和H+，H+再將延胡索酸還原得到琥珀酸[27]。表5中琥珀酸的起始質量濃度為0.173 4 g/L，發(fā)酵結束后的質量濃度為0.091 7 g/L，較發(fā)酵前含量顯著降低。富馬酸在蘋果汁中的含量較低，在發(fā)酵開始時候其含量為0.029 1 g/L，發(fā)酵過程變化趨勢平緩，與酒石酸的變化趨勢相近，發(fā)酵結束時含量為0.049 2 g/L，較發(fā)酵前含量顯著升高。草酸的含量在整個發(fā)酵過程中大幅度上升，發(fā)酵結束后含量可達到0.248 1 g/L。通過短乳桿菌發(fā)酵蘋果汁，擴大了蘋果汁利用率，開發(fā)具有保健功能的新型飲品具有很好的指導意義。

表6 發(fā)酵期間有機酸變化 單位：g/L

注：同一列不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

3 結論

本研究以蘋果汁為原料，確定了蘋果汁乳酸發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基以及蘋果汁乳酸發(fā)酵的最適工藝條件為：接種量8%，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時間6 d。發(fā)酵后的蘋果汁中的總酸含量顯著升高，還原糖含量顯著下降。發(fā)酵期間蘋果酸、琥珀酸含量均持續(xù)減少，乳酸，乙酸、琥珀酸、奎寧酸含量顯著增多，富馬酸、酒石酸含量無明顯變化；通過乳酸菌發(fā)酵極大的改善了蘋果汁的口感，酸度有了較大的提高，以上結果為開發(fā)蘋果汁發(fā)酵飲品提供一定的理論依據(jù)。