李軍，羅娟，涂宗財,3*，張露

1(江西師范大學(xué)， 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌，330022)2(江西師范大學(xué) 江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)3(南昌大學(xué)， 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)俗稱為白鰱、水鰱等[1]，具有生長迅速、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高等特點，在2017年我國淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量中位居第二，達(dá)到385.28萬t[2-3]。在鰱魚的加工過程中，產(chǎn)生大量的魚骨、魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物。其中，魚骨中含有豐富的蛋白、不飽和脂肪酸、鈣、磷等營養(yǎng)成分，是一種優(yōu)良的營養(yǎng)食物資源[4]。

近年來，利用魚骨制備膠原多肽尤其是抗氧化肽成為了研究熱點[5-10]。相比陸生動物來源的膠原多肽而言，水產(chǎn)動物來源的膠原多肽沒有瘋牛病、豬瘟、禽流感等動物疾病的威脅[11]；同時與市場上常見二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等存在致癌風(fēng)險的抗氧化劑相比[12]，水產(chǎn)動物來源的天然抗氧化肽對人體更加安全、有效，其在食品、化妝品和醫(yī)療等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，以鰱魚骨為原料制備高抗氧化活性的膠原多肽的研究鮮有報道。本文以鰱魚骨為原材料，采用單因素實驗、響應(yīng)面優(yōu)化實驗確定鰱魚骨膠原多肽的最佳制備工藝，然后采用Sephadex G-25凝膠色譜對制備得到的膠原多肽進(jìn)行分離純化，得到高抗氧化活性的多肽組分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚骨，由丹江口市優(yōu)優(yōu)水產(chǎn)開發(fā)有限公司提供。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；復(fù)合蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；細(xì)胞色素C、抑肽酶、羥脯氨酸(色譜純)，北京索萊寶科技有限公司；L-氧化型谷胱甘肽、三氟乙酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技有限公司； 2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、K3[Fe(CN)6]、FeCl3(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(FA1104N型)，上海丙林電子科技有限公司；SevenCompact臺式pH計(S220)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6型)，國華電器有限公司；自動凱氏定氮儀(SKD-800型)，上海沛歐分析儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SII)，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；實驗噴霧干燥塔(MDR-5型)，無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)(SR-AON-50)，上海舍巖儀器有限公司；紫外可見分光光度計(U-2910型)，Hitachi High-Tech Science Corporation；HSM高效液相色譜(D-2000)，日本Hitachi公司；氨基酸分析儀(L-8900)，日本Hitachi公司；紫外檢測儀(HD-21-88)，上海琪特分析儀器有限公司；全自動部分收集器(BSZ-160)，上海青浦滬西儀器廠；精密蠕動泵(BT100-2J)，保定蘭格恒流泵有限公司；酶標(biāo)儀(Synergy H1)，美國Bio Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚骨預(yù)處理

鰱魚骨粉制備工藝：

鰱魚骨→解凍→沸水煮5 min→剔除魚肉和膜性組織→沖洗→高壓蒸煮(124 ℃、1.5 h)[4]→去上層脂肪→膠體磨→噴霧干燥→鰱魚骨粉

1.3.2 酶解提取工藝

膠原多肽提取工藝：

鰱魚骨粉→按一定料液比加水→調(diào)節(jié)pH→加酶→水浴酶解→滅酶(100 ℃，10 min)→離心→膠原多肽溶液→凍干→膠原多肽粉末

1.3.3 蛋白酶的篩選

分別選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對魚骨粉進(jìn)行水解，其酶解條件如表1所示[13-14]。以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo)，篩選出合適的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

注：5種蛋白酶酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中福林酚法測定[15]。

1.3.4 魚骨膠原多肽提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗設(shè)計

采用復(fù)合蛋白酶水解魚骨粉制備膠原多肽，以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗設(shè)計。分別固定其他因素，依次評價料液比(1∶20、1∶15、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，g∶mL)、酶添加量(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)對魚骨粉酶解效果的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以膠原多肽得率為響應(yīng)值(Y)，選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)對魚骨粉酶解影響較強(qiáng)的3個因素為自變量，利用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，探索從魚骨中制備膠原多肽的最佳條件。

1.3.5 評價指標(biāo)的測定

1.3.5.1 膠原多肽得率的測定

參照賈瑞波等[16]的方法略作修改，采用Folin-酚法測定酶解液中膠原多肽的含量。以質(zhì)量濃度為 0～200 μg/mL的牛血清白蛋白為橫坐標(biāo)(X)，650 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.001 6X-0.005 8(R2=0.998 5)。取1 mL稀釋到適宜濃度的酶解液進(jìn)行測定，其結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶解液中膠原多肽的含量。參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法進(jìn)行測定原料中總蛋白含量[17]。按公式(1)計算酶解液中膠原多肽得率：

(1)

1.3.5.2 水解度的測定

采用甲醛滴定法[18]測定酶解液中游離氨基氮含量，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法進(jìn)行測定原料中總氮含量[17]。按公式(2)計算酶解液的水解度：

(2)

1.3.6 酶解液中膠原多肽分子質(zhì)量分布的測定

按照GB 31645—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》中高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)進(jìn)行測定酶解液中膠原多肽分子質(zhì)量的分布情況[19]。按照上述最優(yōu)條件制備魚骨膠原多肽溶液，離心取上清液凍干，配制成2 mg/mL的溶液，過0.22 μm水系濾膜后，使用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph，HPLC)上樣分析。以質(zhì)量濃度為2 mg/mL的細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和羥脯氨酸(131.13 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制相對分子質(zhì)量校正曲線。色譜柱：XBridge BEH 125? SEC(3.5 μm，(7.8×300) mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水0.1%TFA)=40∶60；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.7 Sephadex G-25分子篩層析

填料預(yù)處理：稱量30 g Sephadex G-25干凝膠于300 mL燒杯中，加入適量的超純水并攪拌，于室溫下浸泡24 h后使其充分溶脹。

裝柱：選取規(guī)格16 mm×80 cm的層析柱，超純水洗凈后固定在鐵架臺上。出口接上乳膠管，先往層析柱內(nèi)加入少量的超純水，將預(yù)先準(zhǔn)備好的Sephadex G-25填料混勻，緩慢倒入層析柱至液面高度為2～3 cm。連接進(jìn)水口并打開恒流泵，用超純水進(jìn)行平衡至液面高度不再發(fā)生改變。

上樣：將凍干的膠原多肽粉末用超純水配制成濃度為100 mg/mL，過0.22 μm水系濾膜后取2 mL上樣。

洗脫收集：洗脫液：超純水；流速：0.4 mL/min；紫外檢測波長：220 nm；每管收集量：4 mL。將同一組分合并收集，凍干并稱其質(zhì)量。

1.3.8 不同分子質(zhì)量多肽氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》[20]，采用氨基酸分析儀對樣品中氨基酸的含量進(jìn)行測定。

1.3.9 體外抗氧化活性的測定

1.3.9.1 ABTS+·清除能力的測定

采用KETNAWA等[21]方法以ABTS+·清除能力實驗評價不同分子質(zhì)量多肽的抗氧化能力：稱取38.4 mg ABTS和6.623 mg過硫酸鉀混合，蒸餾水溶解后并定容至10 mL配成ABTS+·母液。室溫避光反應(yīng)12～16 h后用0.2 mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋ABTS+·母液至在734 nm處的吸光值為0.7±0.2左右。分別移取50 μL稀釋到適宜濃度的樣品溶液與150 μL ABTS+·溶液于96孔酶標(biāo)板上混勻，室溫下避光反應(yīng)6 min后于734 nm處測定吸光值(Ai)。以50 μL蒸餾水代替樣品的反應(yīng)體系為控制組(Ac)，以150 μL PBS代替ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組(Aj)，以50 μL蒸餾水和150 μL PBS分別代替樣品和ABTS+·溶液的反應(yīng)體系為空白組(Ab)。以谷胱甘肽(glutathione，GSH)為陽性對照，結(jié)果用百分抑制率表示，采用Origin 8.6軟件中的多項擬合計算樣品清除50%的自由基所需樣品的濃度。按公式(3)計算ABTS+·清除能力：

(3)

1.3.9.2 還原能力的測定

采用賈韶千等[22]方法測定不同分子質(zhì)量多肽之間的還原能力。分別移取0.2 mL不同濃度的樣品溶液與0.5 mL 1 % K3[Fe(CN)6]混合，50 ℃水浴20 min后，加入0.5 mL 10% TCA終止反應(yīng)。將反應(yīng)液以5 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL于離心管中，分別加入0.5 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1 % FeCl3，搖勻后置于50 ℃水浴10 min。取200 μL溶液于700 nm處測定吸光值。0.2 mL蒸餾水代替FeCl3作為空白對照。以GSH為陽性對照，OD1.0值表示使反應(yīng)體系的吸光值為1.0時所需要的樣品濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

在蛋白酶的作用下，魚骨中的膠原蛋白會進(jìn)行水解形成膠原多肽，過度水解則會進(jìn)一步將膠原多肽水解成小分子質(zhì)量的短肽和游離氨基酸，導(dǎo)致膠原多肽含量的降低[23]。5 種不同蛋白酶對鰱魚骨的酶解效果如圖1所示。其中，風(fēng)味蛋白酶的水解度最高，然后依次是復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解之后，酶解液中膠原多肽得率最高，達(dá)到43.72 %(P<0.05)，風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶相比，其膠原多肽含量低，是由于水解度高，比其他酶水解更加徹底，由于部分膠原多肽水解形成氨基酸所致。而堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解鰱魚骨中膠原蛋白的能力弱于復(fù)合蛋白酶，水解度較低，故膠原多肽含量低于復(fù)合蛋白酶。由此可見，在酶活力和酶解時間相同的情況下，復(fù)合蛋白酶酶解鰱魚骨制備膠原多肽的效率最高。本次實驗使用的復(fù)合蛋白酶是由多種酶混合復(fù)配而成，主要以堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為主，其主要作用位點是疏水氨基酸[24]，與其他蛋白酶相比，可以獲得更多的抗氧化肽。經(jīng)酶活力測定，復(fù)合蛋白酶的酶活力高于堿性蛋白酶(單酶)，且風(fēng)味蛋白酶的存在又可以降低苦味肽的形成[25]，適用于骨、肉副產(chǎn)物的水解和骨膠原多肽的生產(chǎn)。為了更好地制備高抗氧化活性膠原多肽，節(jié)約成本，綜合考慮選擇復(fù)合蛋白酶用于后續(xù)魚骨膠原多肽制備工藝的優(yōu)化。

圖1 5種蛋白酶的酶解效果

2.2 單因素試驗結(jié)果

復(fù)合蛋白酶酶解鰱魚骨制備膠原多肽的單因素試驗結(jié)果如圖2-a～圖2-e所示。由圖2-a可知，膠原多肽得率隨料液比的增大呈下降的趨勢，水解度先上升后趨于平穩(wěn)，在料液比為1∶10(g∶mL)時，其膠原多肽含量和水解度都較高，當(dāng)料液比繼續(xù)增大，膠原多肽得率反而下降。由圖2-b可知，膠原多肽得率和水解度隨著酶添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶添加量為8 000 U/g時，膠原多肽得率最高，達(dá)49.00 %(P<0.05)，繼續(xù)增大酶添加量，膠原多肽得率反而下降。由圖2-c可知，膠原多肽得率和水解度隨著pH的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)pH為8.0時，膠原多肽得率最高，達(dá)44.38 %(P<0.05)。圖2-a～圖2-c的結(jié)果與劉靜[26]的報道相一致，原因在于底物濃度隨著料液比的增大而增大，但一定量的酶無法酶解過多的底物，導(dǎo)致膠原多肽增加的比例小于底物增加的比例，這也是底物濃度越大其膠原多肽得率越小的主要原因；在適宜溫度的條件下，復(fù)合蛋白酶含量增加，使底物和蛋白酶更加充分反應(yīng)，水解度和膠原多肽得率增大，當(dāng)酶量增加到一定量的時候，酶和底物結(jié)合位點達(dá)到飽和，此時再增加酶量也不會促進(jìn)底物的水解，反而造成酶的浪費；pH過低或過高都會影響復(fù)合蛋白酶的活性，進(jìn)而影響酶解效果。

由圖2-d可知，隨著酶解溫度的升高，膠原多肽得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時，膠原多肽得率達(dá)到最大值40.72 %(P<0.05)，其原因是溫度過高會導(dǎo)致復(fù)合蛋白酶的酶活力下降甚至失活，產(chǎn)物形成的方向發(fā)生改變[22]，這與圖2-c中過低或過高的pH會導(dǎo)致膠原多肽得率和水解度降低的解釋相一致。由圖2-e可知，隨著酶解時間的增加，膠原多肽得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而水解度呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，在當(dāng)酶解時間為4 h時，膠原多肽得率達(dá)到最大值(49.59%)(P<0.05)。當(dāng)酶解反應(yīng)開始后，酶與底物激烈反應(yīng)，使原料的水解度和膠原多肽得率增大，但隨著酶解時間的延長，膠原多肽會被過度水解成氨基酸，使得膠原多肽得率下降[27]。

a-液料比；b-酶添加量；c-pH；d-酶解溫度；e-酶解時間

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)3因素，利用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計和膠原多肽得率結(jié)果

對表2中的試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次多項式方程：Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB+0.75AC+2.500E-003BC-3.99A2-5.05B2-2.38C2，回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗

2.3.2 各因素相互作用分析

酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖3所示，可直觀分析2個因素之間交互作用對膠原多肽得率的影響程度。等高線的形狀可反映出各因素相互作用的強(qiáng)弱，橢圓形則代表2個因素交互作用具有顯著影響，而接近圓形則代表不顯著。由表3和圖3分析可知，因素A、B、C、A2、B2、C2項對膠原多肽得率的影響呈現(xiàn)極顯著水平(P<0.01)，因素A和B交互作用的等高線圖呈橢圓形，對膠原多肽得率的影響具有顯著差異(P<0.05)，而因素A和C、因素B和C之間的交互作用呈圓形，對膠原多肽得率沒有顯著影響。由圖3結(jié)合表3中的F值分析可知，各因素對膠原多肽得率的影響次序：酶解時間>酶解溫度>酶添加量，剔除不顯著項AC、BC，模型方程進(jìn)行優(yōu)化得到：Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB-3.99A2-5.05B2-2.38C2。

圖3 酶添加量、酶解溫度和酶解時間交互作用對膠原多肽得率的影響

2.3.3 最優(yōu)條件的驗證

采用軟件對優(yōu)化后的回歸方程分析可知，當(dāng)酶添加量為8 220.30 U/g、酶解溫度為51.06 ℃、酶解時間為4.38 h時，此時的膠原多肽得率最高，其理論值為49.00 %。按照該條件進(jìn)行驗證試驗，為了方便操作，選取酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時間為4.5 h時，驗證實驗重復(fù)3次，測定膠原多肽得率為(49.00±0.80) %，非常接近理論值，無顯著性差異(P>0.05)，此條件是膠原多肽制備的最優(yōu)條件，證明該模型方程可行。

2.4 膠原多肽分子質(zhì)量分布情況

標(biāo)準(zhǔn)品及其混標(biāo)的HPLC色譜圖如圖4-a所示，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與保留時間的關(guān)系，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lg MW)對保留時間(T)作線性回歸得到相對分子質(zhì)量校正曲線，如圖4-b所示，其相對分子質(zhì)量校正曲線方程：lg MW=6.821 42-0.246 15T(R2=0.997 05)。表明相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lg MW)與保留時間T(min)具有良好的線性關(guān)系，根據(jù)膠原多肽的出峰時間和相對分子質(zhì)量校正曲線方程，可計算膠原多肽粉末各組分的分子質(zhì)量。

a-液相色譜；b-校正曲線

魚骨膠原多肽粉末的HPLC色譜圖和分子質(zhì)量分布如圖5和表4所示，圖中主要出現(xiàn)5個峰，表明魚骨膠原多肽是由5種不同分子質(zhì)量膠原多肽組分所組成，且膠原多肽分子質(zhì)量分布廣，大小不一。由圖5和表4可知，利用復(fù)合蛋白酶對魚骨粉酶解，其膠原多肽主要集中在組分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，分子質(zhì)量為400～3 000 Da，且組分Ⅲ含量最高，約為56.58 %。根據(jù)膠原多肽分子質(zhì)量分布的HPLC色譜圖，采用Sephadex G-25分子層析將其分離純化。

圖5 魚骨膠原多肽的高效液相色譜圖

2.5 Sephadex G-25分子篩層析

凝膠過濾是一種基于分子質(zhì)量大小分離肽的有效方法，已經(jīng)被廣泛用于混合組分多肽的分離[28]。魚骨膠原多肽經(jīng)Sephadex G-25柱洗脫分離之后的圖譜及各組分含量如圖6和表5所示。魚骨膠原多肽被分離成5個組分，凍干后組分Ⅰ～Ⅴ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.50%、28.49%、36.25%、7.55%和1.26%，組分Ⅲ的響應(yīng)值和含量最高(P<0.05)。除去在分離過程中的損失量，其各組分的相對含量與HPLC的結(jié)果基本一致。其中，組分Ⅴ的含量低，分離1次僅有(2.53±0.04)mg的收集量，因考慮時間、經(jīng)濟(jì)成本等具體影響，故收集前4個組分作為后續(xù)的研究對象。

表4 魚骨膠原多肽不同組分的分子量及相對含量

注：相對含量的數(shù)據(jù)來源于HPLC。

圖6 魚骨膠原多肽的Sephadex G-25注洗脫圖譜

表5 不同膠原多肽組分的含量

注：酶解液濃度為100 mg/mL，一次上樣體積2 mL。

2.6 氨基酸組成分析

對樣品進(jìn)行氨基酸組成分析，其含量如表6所示。

表6 膠原多肽及其組分的氨基酸含量比較

注：*表示該氨基酸為疏水氨基酸，#表示該氨基酸為必需氨基酸，ND表示末檢測出該氨基酸。

膠原多肽粉末中甘氨酸(Gly)含量最高，谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)的含量也相對較高，符合膠原蛋白氨基酸組成特征[29]。且樣品分子質(zhì)量較小，主要集中在400～3 000因此可以認(rèn)為該粉末中主要成分是膠原多肽。當(dāng)多肽的N-端或C-端存在疏水氨基酸時，有利于多肽在脂質(zhì)中的溶解，從而提高其抗氧化活性[30-31]，如SONG等[30]使用內(nèi)源性蛋白酶對魷魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解，其水解物中疏水氨基酸的相對含量達(dá)到38.52%，有助于形成疏水結(jié)構(gòu)，使得其具有顯著的抗氧化性。如表6所示，膠原多肽粉末的疏水氨基酸含量僅有33.42 %，經(jīng)Sephadex G-25柱洗脫之后，組分Ⅲ和組分Ⅳ的疏水氨基酸含量增加，分別為40.45 %和44.37%。除此之外，膠原多肽和各組分含有一定量的必需氨基酸。綜上所述，鰱魚骨膠原多肽中某些組分可以作為一種高營養(yǎng)的抗氧化劑膳食補(bǔ)充劑。

2.7 體外抗氧化實驗結(jié)果

2.7.1 ABTS+·清除能力

膠原多肽及其各組分的ABTS+·清除能力如圖7所示，其IC50值如表7所示。在樣品的測試濃度(0.015～1.0 mg/mL)，所有樣品均具有較好的ABTS+·清除能力，且ABTS+·清除能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強(qiáng)的ABTS+·清除能力(P< 0.05)，其IC50值為0.02 mg/mL，明顯低于膠原多肽粉末(IC50=0.15 mg/mL)、組分Ⅲ(IC50=0.47 mg/mL)、組分Ⅱ(IC50=0.69 mg/mL)和組分Ⅰ(IC50=0.74 mg/mL)，略高于GSH(IC50=0.01 mg/mL)。由表6可知，組分Ⅳ的疏水氨基酸含量最高，使其抗氧化性增加；而膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力卻強(qiáng)于組分Ⅲ，這是因為一些非疏水氨基酸，如Gly、Asp和Lys，其含量的高低也與抗氧化活性有關(guān)[32-33]，而膠原多肽中的Gly、Asp和Lys含量遠(yuǎn)高于組分Ⅲ，故導(dǎo)致膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力強(qiáng)于組分Ⅲ。CHI等[34]從大黃魚肉中分離出3種抗氧化肽，其中ABTS+·清除能力最高的5肽， IC50為0.31 mg/mL，其抗氧化活性低于組分Ⅳ。

圖7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力

表7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力 的IC50值和還原能力的OD1.0值

注：ND表示末檢測。

2.7.2 還原能力

樣品中的還原劑能將鐵氰化鉀(Fe+3)還原成亞鐵氰化鉀(Fe2+)，進(jìn)一步和FeCl3反應(yīng)生成在700 nm處具有最大吸光度的普魯士藍(lán)，其吸光值越大，則表示還原能力及抗氧化性越強(qiáng)[35-36]。鰱魚骨膠原多肽及其組分的還原能力如圖8所示，其OD1.0值如表7所示。在樣品的測試濃度(0～50 mg/mL)，所有樣品均有還原能力，且還原能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強(qiáng)的還原能力(P< 0.05)，其OD1.0值為19.16 mg/mL，明顯低于膠原多肽粉末(OD1.0=21.85 mg/mL)、組分Ⅲ(OD1.0=47.49 mg/mL)、組分Ⅰ和組分Ⅱ，高于GSH(OD1.0=0.86 mg/mL)，各樣品的還原能力結(jié)果與ABTS+·清除能力基本一致。楊露等[5]制備的馬面魚骨多肽在50 mg/mL的A700 nm的值僅約為0.4，其還原能力遠(yuǎn)低于本論文的膠原多肽粉末和各組分。

圖8 膠原多肽及其不同組分的還原能力

3 結(jié)論

本論文以鰱魚骨為原材料，以膠原多肽得率結(jié)合水解度為指標(biāo)，篩選出復(fù)合蛋白酶為制備魚骨中膠原多肽的最優(yōu)酶。通過單因素實驗、響應(yīng)面優(yōu)化確定鰱魚骨制備膠原多肽的最佳工藝條件為：酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時間為4.5 h，此時，膠原多肽得率為49.00 %。通過高效體積排阻色譜法分析得出其膠原多肽由5個組分組成，分子質(zhì)量主要集中在400～3 000 Da。經(jīng)Sephadex G-25過濾色譜法分離，各組分都具有一定的抗氧化能力，其中組分Ⅳ的ABTS+·清除能力和還原能力最高，其IC50和OD1.0值分別為0.02 mg/mL和19.16 mg/mL。本實驗的研究可為制備高抗氧化魚骨多肽提供數(shù)據(jù)支撐，也可為提高魚骨資源利用率提供理論依據(jù)。