林洪斌，郭訓練,2，劉茜，邢亞閣*，許青蓮，方佳興，車振明

1(西華大學 食品與生物工程學院, 四川 成都, 610039) 2(商丘學院 風景園林學院，河南 商丘，476000)3(西華大學 西華學院, 四川 成都，610039)

殼聚糖(chitosan,CS)是從昆蟲和蝦、蟹等甲殼類動物的外殼中提取的甲殼素經(jīng)濃堿溶液處理后脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物降解性及成膜性等優(yōu)點，同時其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均有一定的抑制作用[1-2]，但其抗菌性易受外界因素影響，純殼聚糖膜用于果蔬保鮮時抗菌效果較差[3]，且自身力學性能較差，使其應用具有局限性。而將殼聚糖制備成納米殼聚糖粒子后，利用納米材料獨特的尺寸效應在保留殼聚糖優(yōu)良性質(zhì)的同時，能明顯提升其力學性質(zhì)及抗菌性，在果蔬保鮮領域有巨大的應用潛力[4]。

現(xiàn)階段，國內(nèi)外采用離子交聯(lián)法制備納米殼聚糖的研究很多[12-13]，作為重要指標的納米殼聚糖粒徑和Zeta電位常常受到殼聚糖溶液濃度、交聯(lián)劑溶液濃度、殼聚糖和交聯(lián)劑溶液比例、反應溶液pH、超聲處理條件等諸多因素的影響[14]，如何得到窄尺寸，分布均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米殼聚糖粒子并研究其抗菌性成為研究人員關注的重點。FAN等[15]采用離子交聯(lián)法制備單分散性的殼聚糖納米粒子,通過優(yōu)化制備條件，最終得到粒徑為138 nm，Zeta電位為35 mV的殼聚糖納米粒子。DE PINHO NEVES等[16]采用23因子設計優(yōu)化離子交聯(lián)技術(shù)制備殼聚糖納米粒子的工藝，發(fā)現(xiàn)納米顆粒的形成主要取決于殼聚糖與三聚磷酸鈉的比例。而MANIKANDAN等[17]采用離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子，并發(fā)現(xiàn)其在離體葉片條件下，對稻瘟病毒具有顯著抑制作用。

本文為得到粒徑更小，分布均勻且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米殼聚糖粒子，采用離子交聯(lián)法制備納米殼聚糖粒子。通過單因素和Box-Behnken響應面，以納米殼聚糖平均粒徑 (Z-ave) 和Zeta電位 (ZP) 為響應值，利用納米粒度儀考察研究CS濃度，TPP濃度，CS與TPP的體積比，CS溶液pH值等因素對制備納米殼聚糖平均粒徑和Zeta電位的影響，優(yōu)化得到納米殼聚糖粒子的最佳制備工藝條件，為納米殼聚糖粒子的制備和應用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(脫乙酰度85.61%)，濟南海得貝海洋生物工程有限公司；三聚磷酸鈉、冰乙酸、NaOH(分析純), 成都市科龍化工試劑廠；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯(生物試劑), 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

菌種：大腸桿菌 (E.coli)、金黃色葡萄球菌 (S.aureus),西華大學果蔬保鮮與加工研究所。

1.2 儀器與設備

Nano-ZS納米粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；PHS-320酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；SD-1000噴霧干燥器，EYELA東京理化器械株式會社；BPG-9240A精密鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；RH digital數(shù)顯型加熱磁力攪拌器，廣州艾卡儀器設備有限公司；UV2800紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；GI54DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器，廈門致微儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 殼聚糖納米粒子的制備

參考CALVO等[18]和FAN等[15]的方法，并稍作修改。稱取一定質(zhì)量的殼聚糖溶解于體積分數(shù)1%的冰乙酸溶液中，配制成0.75 mg/mL的殼聚糖溶液，磁力攪拌1 h，調(diào)節(jié)pH值至5.0，溶液用0.45 μm的濾膜過濾以除去溶液中的不溶性雜質(zhì)，制得殼聚糖儲備液；配制濃度為0.75 mg/mL的TPP水溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，制得TPP儲備液。移取6.0 mL殼聚糖儲備液于50 mL圓底離心管中，在轉(zhuǎn)速為600 r/min磁力攪拌器上，快速加入1.0 mL的TPP儲備液，持續(xù)攪拌10 min，即得殼聚糖納米粒子懸浮液。使用噴霧干燥器制備殼聚糖納米顆粒[19]。噴霧干燥條件為：流速120 mL/h，干燥氣流量為0.35 m3/min，噴霧加壓為130 kPa，入口溫度為121 ℃，出口溫度為65 ℃。將殼聚糖納米粒子置于玻璃管中保存。

1.3.2 納米殼聚糖的粒徑分布、Zeta電位和多分散指數(shù)(polydispersity, PDI)的測量

使用納米粒度分析儀分別測量納米粒子的平均粒徑(Z-ave)、多分散指數(shù) (PDI)以及Zeta電位 (ZP) 等數(shù)據(jù)，測試溫度25 ℃，光檢測角度90°。

1.3.3 單因素實驗

設定CS溶液的濃度為0.75 mg/mL，TPP溶液的濃度為0.75 mg/mL，V(CS)∶V(TPP)=6∶1，CS溶液的pH值為5.0，使用磁力攪拌器600 r/min攪拌10 min為初始條件，分別考察的實驗變量包括CS溶液的濃度 (0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/mL)、TPP溶液的濃度 (0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/mL)、CS與TPP的體積比(3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1)、CS溶液的pH值 (3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)對納米殼聚糖粒子平均粒徑和Zeta電位的影響。

1.3.4 響應曲面實驗設計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以Z-ave和Zeta電位為響應值，以CS濃度、TPP濃度、V(CS)∶V(TPP)、CS溶液的pH值為自變量，利用Design Expert 8.0.6實驗設計軟件進行四因素三水平共29組的響應曲面優(yōu)化實驗[20]。實驗因素水平如表1所示。

表1 響應面實驗設計因素和水平編碼值Table 1 Independent levels and code of responsesurface methodology

1.3.5 納米殼聚糖抗菌實驗

將大腸桿菌及金黃色葡萄球菌分別接種于固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用0.85%的生理鹽水洗脫，離心洗滌，將菌體重新懸浮，調(diào)整菌懸液濃度，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取不同體積的納米殼聚糖溶液，分別加入裝有50 mL營養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，使其終濃度分別達到0.2、0.4、0.6 mg/mL。121 ℃滅菌20 min，冷卻后，加入1 mL菌懸液，37 ℃，120 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，使用紫外分光光度計每隔一段時間測定OD610。以等體積的無菌去離子水代替納米殼聚糖作為對照，每個樣品重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗設計優(yōu)化，采用SPSS 22.0和Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，顯著性水平P<0.05，結(jié)果表示為均值±標準偏差；Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 CS溶液濃度對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響

殼聚糖鏈中的氨基陽離子在酸溶液中被質(zhì)子化，與TPP中的磷酸基團負離子發(fā)生正負電荷的吸引，發(fā)生交聯(lián)作用從而形成殼聚糖納米粒子[21]。設定TPP濃度為0.75 mg/mL，CS與TPP的體積比為6∶1，CS溶液的pH值為5.0，考察CS濃度對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響，如圖1所示。隨著殼聚糖溶液濃度從0.25增大至2.0 mg/mL，粒子的粒徑先保持83.6 nm不變，隨后逐漸增加到335.9 nm，Zeta電位從+15.57增加到+27.71 mV。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因主要與質(zhì)子化的氨基基團的數(shù)量有關。當CS溶液處于低濃度狀態(tài)時，氨基基團含量低，不能與磷酸基團進行有效的接觸，離子交聯(lián)作用較弱，形成的納米粒子粒徑較小，隨著殼聚糖濃度的增加，質(zhì)子化的氨基基團增加，體系中的1個磷酸基團可與多個氨基基團產(chǎn)生交聯(lián)，分子間氫鍵增加，形成的納米粒子粒徑較大；Zeta電位是對殼聚糖分子之間相互排斥或吸引力的強度的度量，其絕對值越大表示體系越加穩(wěn)定，隨著CS溶液濃度升高，氨基質(zhì)子化程度增加從而帶更多正電荷，Zeta電位逐漸增加。綜合考慮，CS濃度為0.75 mg/mL附近較為合適。

圖1 CS溶液濃度對粒子粒徑和Zeta電位的影響Fig.1 Effect of CS solution concentration on particle sizeand Zeta potential

2.1.2 TPP溶液濃度對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響

固定CS濃度為0.75 mg/mL，CS與TPP的體積比6∶1，CS溶液的pH值為5.0，考察TPP濃度對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響，如圖2所示。隨著TPP溶液濃度的增加，納米殼聚糖的粒徑從93.1 nm增加到147.1 nm，而Zeta電位幾乎呈線性降低，從+22.62 mV降低到+14.53 mV。主要是隨著TPP濃度增加，更多的磷酸基團與質(zhì)子化氨基基團發(fā)生離子交聯(lián)作用，形成的納米粒子逐漸增加，分子間形成更多的氫鍵，從而粒徑增大，Zeta電位減小。綜上，選取TPP濃度0.75 mg/mL進行下一步優(yōu)化。

圖2 TPP溶液濃度對粒子粒徑和Zeta電位的影響Fig.2 Effect of TPP solution concentration on the size andZeta potential

2.1.3 CS與TPP的體積比對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響

固定CS濃度為0.75 mg/mL，TPP濃度為0.75 mg/mL，CS溶液的pH值為5.0，考察CS與TPP的體積比對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響，如圖3所示。

圖3 CS與TPP溶液體積比對粒子粒徑和Zeta電位的影響Fig.3 Effect of volume ratio of CS to TPP solution onparticle size and Zeta potential

隨著CS與TPP的體積比增大，粒徑先從135.2 nm減小到106.7 nm，當體積比達到7∶1時，粒徑突然增大到124.4 nm，主要是由少量的磷酸基基團與大量的質(zhì)子化氨基基團交聯(lián)造成的；隨著CS與TPP體積比增加，體系中納米粒子表面質(zhì)子化氨基的數(shù)量逐漸增多，導致Zeta電位持續(xù)增加，從+20.79 mV增大到+23.50 mV。綜上，選擇CS與TPP體積比為6∶1作為下一步優(yōu)化條件。

2.1.4 CS溶液pH值對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響

殼聚糖是高分子的弱電解質(zhì)，其電離常數(shù)pKa約為6.5，溶液pH值的增大可使殼聚糖分子上氨基的質(zhì)子化程度降低[22]。溶液的pH值對TPP的電荷數(shù)也有一定的影響，溶液pH值的增大會導致TPP所含負電荷數(shù)量增加[23]，所以pH值是納米殼聚糖粒子制備中的關鍵因素。固定CS濃度為0.75 mg/mL，TPP濃度為0.75 mg/mL，CS與TPP的體積比為6∶1，考察CS溶液的pH值對納米殼聚糖粒徑和Zeta電位的影響。結(jié)果如圖4所示，當pH值低于5.0時，隨著CS溶液pH值的增大，粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢，在pH值為5.0時，粒徑取得最小值106.7 nm，隨后粒徑逐漸增大，在pH值為6.5時，粒徑達到216.1 nm。隨著pH值的增大，分子上氨基可結(jié)合氫離子減少，所帶正電荷減少，Zeta電位逐漸下降。綜合考慮選擇pH值為5進行優(yōu)化。

圖4 殼聚糖溶液pH值對粒子粒徑和Zeta電位的影響Fig.4 Effect of pH value of chitosan solution on particlesize and Zeta potential

2.2 響應面實驗設計及結(jié)果

采用Box-Behnken實驗設計，以CS濃度 (A)、TPP濃度 (B)、CS與TPP的體積比 (C) 和殼聚糖溶液的pH值 (D) 為自變量，以粒徑 (Y1) 和Zeta電位 (Y2) 為響應值，進行響應面優(yōu)化分析。實驗設計及結(jié)果見表2。

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件，對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸分析，建立回歸模型，分別以Z-Ave (Y1)和ZP (Y2)為因變量，得到編碼值的多元二次回歸方程為：

Y1=122.36+0.20A-0.82B-2.31C-0.075D+2.47AB-0.35AC+1.98AD-0.15BC+1.23BD-0.33CD+3.69A2+5.12B2+15.38C2+5.33D2

Y2=23.32+0.43A+0.17B+1.01C+0.037D-0.092AB-0.46AC-0.11AD+0.17BC+0.31BD+0.13CD-0.77A2-0.59B2-3.31C2-1.05D2

表2 響應曲面實驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of responsesurface methodology

2.3 回歸方程方差分析

在平均粒徑 (Y1) 模型中，一次項CS與TPP的體積比 (C) 以及二次項A2、B2、C2和D2對納米殼聚糖的平均粒徑均有極顯著的影響 (P<0.01)；交互項中CS濃度 (A) 和TPP濃度 (B)的交互作用對納米殼聚糖的平均粒徑影響顯著 (P<0.05)，其他交互項影響不顯著。按結(jié)果對影響作用排序為C>B>A>D。

表3 殼聚糖納米粒子平均粒徑的二次回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regressionmodel for Z-Ave of chitosan nanoparticles

注：“**”為差異極顯著 (P<0.01)；“*”為差異顯著 (P<0.05)；“-”為差異不顯著(下同)

在Zeta電位回歸方程中，一次項C，二次項中C2和D2對Zeta電位 (Y2) 的影響呈極顯著水平 (P<0.01)；二次項A2對Zeta電位 (Y2)的影響顯著 (P<0.05)，交互項對Zeta電位 (Y2) 的影響均不顯著。按結(jié)果對影響作用進行排序為C>A>B>D。

2.4 響應面分析

各因素交互作用對納米殼聚糖粒徑影響的響應曲面，如圖5所示。響應面開口向上，響應值存在極小值。固定其他變量，沿C變量方向響應面較陡，等高線變化密集，當C固定，沿其他變量方向響應曲面變化較緩，等高線較稀疏，說明C比A、B和D對納米殼聚糖平均粒徑的影響大，與方差分析結(jié)果相符。其他因素對納米殼聚糖粒徑的影響作用中，TPP濃度大于CS濃度，CS溶液pH大于CS濃度。

表4 殼聚糖納米粒子Zeta電位二次回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for quadratic regressionmodel for Zeta potential of chitosan nanoparticles

圖5 A、B、C、D交互作用對納米殼聚糖粒徑大小影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface of mutual-influence for theinteractive effects of A,B,C and D on theparticle size of nano-chitosan

各因素交互作用對納米殼聚糖Zeta電位影響的響應曲面，如圖6所示。從圖6可以看出，響應面開口向下，響應值存在極大值。沿C方向響應曲面較其他因素更為陡峭，說明C對納米殼聚糖Zeta電位的影響更為顯著，與方差分析結(jié)果一致；同理，CS濃度影響作用大于TPP濃度，CS溶液pH影響作用比CS濃度更為顯著，CS溶液pH影響作用大于TPP濃度。

圖6 A、B、C、D交互作用對納米殼聚糖Zeta電位影響的響應曲面圖Fig.6 Response surface of mutual-influence for theinteractive effects of A、B、C and D on the Zetapotential of nano-chitosan

2.5 驗證實驗

通過響應面優(yōu)化得到制備納米殼聚糖的最佳條件，即CS濃度為0.76 mg/mL，TPP濃度為0.77 mg/mL，CS與TPP的體積比為4.11∶1，殼聚糖溶液的pH值為5.0。納米殼聚糖的粒徑和Zeta電位的理論預測值分別為122.3 nm和+23.43 mV。利用納米粒度儀測定最優(yōu)條件制備的納米殼聚糖的粒徑、Zeta電位和分散度，實驗結(jié)果表明，納米殼聚糖的粒徑為119.2 nm，Zeta電位為+22.8 mV，與理論值偏差分別為2.53%、2.69%，說明響應面回歸模型可以很好地預測各因素與粒徑和Zeta電位之間的關系。最優(yōu)條件下制備的納米殼聚糖的粒徑分布如圖7所示，粒徑分布顯示的峰較窄，說明粒子分布較集中，大小較均一， PDI為0.176(<0.3)，粒子的分散程度均勻[24]，適合進一步的研究評估。

圖7 納米殼聚糖的粒徑分布Fig.7 Graphs of size distribution of nano-chitosan

2.6 納米殼聚糖粒子抗菌試驗結(jié)果

吸光度與細菌菌懸液濃度間存在線性正比關系，由圖8可看出不同濃度納米殼聚糖對大腸桿菌的抑制作用，在24 h內(nèi)各實驗組對應的OD610均小于對照組，表明納米殼聚糖對細菌的生長具有一定的抑制作用。隨著處理時間達到3 h后，不同濃度納米殼聚糖抗菌性表現(xiàn)出較明顯差異。濃度0.2 mg/mL的納米殼聚糖，在6～15 h之間其OD610與對照組接近，抑菌作用不明顯。當濃度增大到0.4 mg/mL時，前6 h OD610處于極低的范圍，6 h后開始快速上升，大腸桿菌開始快速繁殖。當濃度達到0.6 mg/mL時，表現(xiàn)出極為明顯的抑制作用，其OD610在6 h后與水平軸趨于平行且保持穩(wěn)定，說明大腸桿菌的生長繁殖一直處于有效抑制的狀態(tài)。

圖8 不同濃度納米殼聚糖對大腸桿菌的時間抗菌曲線Fig.8 The growth curve and time-kill curve of E. coli atvarious concentrations of chitosan nanoparticles

如圖9所示，隨著納米殼聚糖溶液濃度的增加，其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用也越強。與對照組相比，當納米殼聚糖濃度為0.2 mg/mL時，在3 h后OD610較對照組偏低，呈現(xiàn)與對照組相似的變化規(guī)律，說明此濃度對金黃色葡萄球菌抑菌作用不強。濃度為0.4 mg/mL納米殼聚糖在前12 h對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著的抗菌性，但12 h后OD610快速上升，金黃色葡萄球菌開始快速增多。濃度為0.6 mg/mL納米殼聚糖，其OD610始終保持極低且穩(wěn)定的趨勢，說明此濃度下金黃色葡萄球菌生長被完全抑制。

圖9 不同濃度納米殼聚糖對金黃色葡萄球菌的時間抗菌曲線Fig.9 The growth curve and time-kill curve of S. aureuat various concentrations of chitosan nanoparticles

納米材料由于表面帶正電荷，依靠靜電相互作用吸附到細胞膜,通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)部并與之發(fā)生物理或化學作用，影響細胞的生理活動最終達到殺死細胞的目的。王杰等[25]制備的雜多藍負載的殼聚糖納米粒子質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL 時對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌抑制率達到99%。宋玉民等[26]制備了納米AgBr/殼聚糖雜化材料，顯著提升殼聚糖抗菌性，并確定其對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.625 mg/mL。而本實驗可以看出當納米殼聚糖粒子濃度達到0.6 mg/mL時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均被完全抑制，表現(xiàn)出良好的抗菌性。同時相較于大腸桿菌，3 h后金黃色葡萄球菌實驗組OD610下降趨勢更為明顯，說明納米殼聚糖粒子對金黃色葡萄球菌抑制作用更強，與馬新賢等[27]結(jié)論一致。

3 結(jié)論

采用離子交聯(lián)法，以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，制備殼聚糖納米粒子，通過單因素實驗和響應面實驗，以納米殼聚糖粒子的粒徑和Zeta電位為考察指標，進行工藝優(yōu)化，得到的最佳制備工藝條件為：CS濃度為0.76 mg/mL，TPP濃度為0.77 mg/mL，CS與TPP的體積比為4.11∶1，殼聚糖溶液的pH值為5.0。在該條件下，納米殼聚糖粒子的粒徑和Zeta電位分別為119.2 nm，+22.8 mV，與模型理論預測值接近,制備所得納米殼聚糖粒子分布較集中，分散程度均勻，因此，利用響應面法優(yōu)化殼聚糖納米粒的制備工藝是可行的，且納米殼聚糖粒子濃度0.6 mg/mL時具有良好的抗菌性，為納米殼聚糖粒子應用到果蔬保鮮中提供理論依據(jù)。