楊慧，步雨珊，劉奧，劉同杰，張?zhí)m威，易華西

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266000)

酸奶是以嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為主要菌種發(fā)酵而成的乳制品，因其獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)吸引了大批消費者[1]。然而，酸奶在儲運過程中，菌體會利用殘存乳糖繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生過度酸味，影響酸奶質(zhì)量，即后酸化現(xiàn)象。為緩解酸奶后酸化現(xiàn)象，目前的措施主要有誘變育種[2]、調(diào)節(jié)發(fā)酵菌株比例[3]、補充抗菌物質(zhì)[4]等。誘變育種操作復(fù)雜，難以維持穩(wěn)定性狀，突變菌株的安全性無法保障[5]。調(diào)節(jié)發(fā)酵菌株比例雖然對解決后酸化有一定效果，但在實際工業(yè)操作過程中很難保持各批次產(chǎn)品接種量的一致性[3]。Nisin是是一種應(yīng)用廣泛的細菌素[6]，添加Nisin可以有效緩解酸奶的后酸化，但是Nisin抑菌譜窄，在使用過程中需要與其他防腐劑結(jié)合[7]，增加了企業(yè)生產(chǎn)成本[8]。如何有效延緩后酸化同時減少企業(yè)成本，是目前研究熱點。

隨著相關(guān)研究的不斷深入，有研究表明在酸奶中接種輔助菌株不僅可有效緩解后酸化，而且可以改善酸奶的感官品質(zhì)。尚楠等[3]發(fā)現(xiàn)在酸奶中接種產(chǎn)細菌素雙歧桿菌L-SN能有效抑制酸奶的后酸化，并能顯著提高酸奶的持水力和黏度，改善酸奶品質(zhì)。其木格蘇都[9]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵乳中接種益生菌LactobacilluscaseiZhang可以賦予產(chǎn)品較好的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味。本實驗室前期從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選獲得一株產(chǎn)細菌素的植物乳桿菌LactobacillusplantarumQ7，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性食品腐敗菌(李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、沙門氏菌等)均具有抑制作用[10]。本研究通過在酸奶原有菌株的基礎(chǔ)上接種不用劑量的植物乳桿菌L.plantarumQ7共同發(fā)酵，探究其對酸奶后酸化及酸奶品質(zhì)的影響，以期開發(fā)一種縮短發(fā)酵時間，緩解酸奶后酸化，延長貨架期的新型酸奶輔助發(fā)酵菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

L.plantarumQ7，中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院功能性乳品與益生菌工程研究室提供。保加利亞乳桿菌Lactobacillusbulgaricusinm25，嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilusinm25，江蘇微康生物科技有限公司。

1.1.2 主要實驗材料

脫脂乳粉、白砂糖。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司；iCinac型酸化監(jiān)控儀，法國AMS公司；APV-2000型高壓均質(zhì)機，斯比克公司；TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC公司；TG20KR-D型高速冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；LDZX-75KBS型全自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GHP-9050型隔水式培養(yǎng)箱，上?；厶﹥x器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌Q7對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響

取10 μL活化的指示菌菌液接種于培養(yǎng)基中，并將含有指示菌的半固體培養(yǎng)基倒入含牛津杯的平皿上，待培養(yǎng)基凝固后，取出牛津杯，向孔洞中加入150 μLL.plantarumQ7發(fā)酵液，在4 ℃冰箱中水平靜置1 h，之后置于37 ℃培養(yǎng)。12 h后觀察抑菌圈，抑菌圈直徑用游標卡尺測量[11]。

1.2.2 植物乳桿菌Q7合成細菌素時效性測定

將活化好的植物乳桿菌Q7以2%(體積分數(shù))的比例接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)14 h，每2 h取發(fā)酵液離心獲取上清，8 000 r/min離心5min，除去菌體。上清液用5 mol/L的NaOH調(diào)至pH 6.0～6.5，0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參?.2.1進行抑菌圈測定。

1.2.3 酸奶制備

將脫脂乳粉(添加量110 g/L)加入蒸餾水加熱攪拌，待溫度升至55 ℃時，加入蔗糖(添加量80 g/L)并攪拌均勻；均質(zhì)(60 ℃，20 MPa)后將樣品分裝，95 ℃高溫滅菌10 min，冷卻到42 ℃接種發(fā)酵劑，恒溫發(fā)酵至pH接近4.5時，停止發(fā)酵， 4 ℃冷卻后熟。

1.2.4 試驗設(shè)計及分組

試驗設(shè)置3組酸奶，按接種比例劃分為對照組、L.plantarumQ7低劑量組、L.plantarumQ7高劑量組。對照組為嗜熱鏈球菌(5×106CFU/mL)和保加利亞乳桿菌(5×106CFU/mL)接種比例1∶1；L.plantarumQ7低劑量組為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶L.plantarumQ7接種比例1∶1∶1；L.plantarumQ7高劑量組為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶L.plantarumQ7接種比例1∶1∶2。發(fā)酵期間每10 min測定pH，在4 ℃貯藏期間每隔3 d測定pH、可滴定酸度，總活菌數(shù)、析水率。

1.2.5 酸度的測定

pH測定：采用iCinac型酸化監(jiān)控儀進行pH測定。

可滴定酸度：參考GB 5009.239—2016[12]。

1.2.6 活菌數(shù)的測定

根據(jù)GB 4789.2—2016[13]中菌落總數(shù)測定的方法，利用菌落平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.2.7 析水率的測定

稱取20 g樣品，1 000 r/min離心10 min，稱取沉淀質(zhì)量，按公式(1)計算析水率[14]：

(1)

1.2.8 質(zhì)構(gòu)測定

使用TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀采用兩次咀嚼測試程序(texture profile analysis，TPA)對酸奶進行質(zhì)構(gòu)分析[15-16]。參數(shù)設(shè)置如下：力量感應(yīng)源ILC/500 N，底部類型為直徑50 mm圓柱形探頭，形變百分量35%，檢測速度60.0 mm/min，觸發(fā)力0.75 N。

1.2.9 感官鑒評

根據(jù)中國乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)范RHB 103—2004《酸牛乳感官質(zhì)量評價細則》[17]，選取10位經(jīng)過感官鑒評培訓(xùn)的食品專業(yè)的學(xué)生作為鑒評小組(男女比例為1∶1)，從色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)3個方面對3組酸奶進行感官鑒評。采取百分制，其中色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)分別占10分、40分、50分。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

試驗設(shè)置3組平行，結(jié)果表示為平均值±標準差。采用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P<0.05)。相同字母表示無顯著差異，不同字母表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌Q7對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響

L.plantarumQ7對保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長影響如圖1。

圖1 L. plantarum Q7對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長影響Fig.1 Effects of L. plantarum Q7 on the growth ofL. bulgaricus and S. thermophilus

L.plantarumQ7對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長繁殖均有一定的抑制作用，對保加利亞的抑制作用大于對嗜熱鏈球菌。有研究表明，保加利亞乳桿菌是導(dǎo)致后酸化的主要菌株[18]。如果能在酸奶貯藏期間抑制保加利亞乳桿菌生長，可以達到延緩后酸化的作用。該抑菌效果是在MRS培養(yǎng)系統(tǒng)中進行，L.plantarumQ7在牛乳中對保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長是否有類似的影響有待進一步研究。

2.2 L. plantarum Q7合成細菌素時效性及其對酸奶發(fā)酵的影響

42 ℃恒溫發(fā)酵過程中每10 min測定1次pH，3組酸奶均在3.5 h內(nèi)完成發(fā)酵，其中對照組的酸奶在3.45 h到達發(fā)酵終點(pH=4.5)。接種L.plantarumQ7的2組酸奶在發(fā)酵過程中pH均偏低，高劑量組酸奶pH最低，2組酸奶在3.2 h到達發(fā)酵終點，縮短發(fā)酵時間15 min。L.plantarumQ7細菌素產(chǎn)量變化如圖2所示，發(fā)酵初期細菌素產(chǎn)量緩慢增長，4 h以后細菌素產(chǎn)量迅速增長；酸奶發(fā)酵時間在3.5 h內(nèi)，表明在酸奶發(fā)酵期間細菌素的產(chǎn)量較少，不足以抑制保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長，且3種菌株能協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酸，加快了產(chǎn)酸進程，縮短了發(fā)酵時間。在酸奶貯藏期，L.plantarumQ7合成細菌素對保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌具有一定抑制作用，達到緩解后酸化的效果。

圖2 L. plantarum Q7合成細菌素時效性及其對酸奶發(fā)酵的影響Fig.2 Aging effect of L. plantarum Q7 on bacteriocinsynthesis and its effect on yogurt fermentation

2.3 植物乳桿菌對酸奶后酸化的影響

2.3.1 酸奶貯藏過程中pH 的變化

酸奶4 ℃冷藏22 d，pH變化如圖3所示。3組酸奶pH在冷藏期間均呈下降趨勢，其中L.plantarumQ7低劑量組酸奶pH下降最為平緩，且在冷藏期間的pH均高于其他2組。酸奶pH是評價酸奶品質(zhì)的一個重要指標，一般酸奶的pH在4.2～4.5之間[19]，低劑量組的酸奶在冷藏期間pH均在此范圍中，而對照組酸奶從第13天開始，pH低于4.2，這與尚楠等[3]的研究結(jié)果一致，說明貯藏期間L.plantarumQ7的細菌素產(chǎn)量能夠抑制保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的生長，但不會影響酸奶的酸度。高劑量組酸奶從第4天開始pH低于4.2，可能是因為高劑量的L.plantarumQ7產(chǎn)酸過度導(dǎo)致，表明接種L.plantarumQ7可以在一定程度上緩解酸奶后酸化，但是與L.plantarumQ7呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 酸奶貯藏過程中pH的變化Fig.3 Change of pH value of yoghurt during storage

2.3.2 酸奶貯藏過程中可滴定酸度的變化

3組酸奶在冷藏期間可滴定酸度變化如圖4。3組酸奶的酸度在前19 d均呈升高趨勢，第22天酸度下降，主要因為酸奶中的活菌繼續(xù)利用乳糖產(chǎn)酸所致[3]。低劑量組酸奶可滴定酸度在3組酸奶中最低，可能是L.plantarumQ7細菌素產(chǎn)量達到了抑制其他菌株活性的效果，但不會過度抑制。有研究報道，酸奶的最佳酸度為80～120°T[20-21]，3組酸奶的酸度均在此范圍內(nèi)。低劑量組酸奶酸度在冷藏期間一直低于對照組，表明低劑量L.plantarumQ7可以減緩酸奶酸化程度。

圖4 酸奶貯藏過程中可滴定酸度的變化Fig.4 Change of acidity of yoghurt during storage

2.3.3 酸奶貯藏過程中活菌數(shù)的變化

3組酸奶在貯藏過程中活菌總數(shù)變化如圖5。隨著貯藏時間的延長，酸奶中的總活菌數(shù)呈下降趨勢，在第7天高劑量組活菌數(shù)急劇下降，可能是高劑量組產(chǎn)生的細菌素對其他菌株的生長起到一定程度的抑制作用，導(dǎo)致菌落總數(shù)下降。在第7天以后菌落總數(shù)變化保持平緩的狀態(tài)，第22天仍保持1×108CFU/mL，可能在這些菌大部分由L.plantarumQ7組成，貯藏后期L.plantarumQ7繁殖成為優(yōu)勢菌。低劑量組酸奶與對照組酸奶活菌數(shù)變化趨勢基本一致，表明低劑量L.plantarumQ7對酸奶總活菌數(shù)的影響并不明顯。

圖5 酸奶貯藏過程中各組菌落總數(shù)的變化Fig.5 Change of viable cells during storage

2.3.4 酸奶貯藏過程中析水率的變化

析水率越高說明酸奶乳清析出越多，凝固性越差。3組酸奶在貯藏過程中的析水率變化如圖6。3組酸奶的析水率隨著時間延長總體變化不規(guī)律，但是變化趨勢基本一致。3組酸奶從第1天～第4天析水率上升，第4天各組的析水率均達到最大值，從第4天到第16天酸奶析水率整體呈下降趨勢，而從16 d以后，析水率大幅回升。酸奶析水率的變化與蛋白水解酶有關(guān)，乳酸菌分泌的蛋白水解酶隨著貯藏時間的延長而增加，進而影響酸奶的析水率[22]。3組酸奶的變化趨勢一致，表明L.plantarumQ7對酸奶析水率變化沒有明顯影響。

圖6 酸奶貯藏過程中析水率的變化Fig.6 Change of water-discharging rate of yoghurt duringstorage

2.3.5 質(zhì)構(gòu)檢測

對3組酸奶進行質(zhì)構(gòu)檢測，結(jié)果如表1。L.plantarumQ7高劑量組酸奶硬度、黏附性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性與對照組均無顯著差異，而低劑量的L.plantarumQ7可以顯著降低酸奶的硬度(P<0.05)，顯著提高酸奶的內(nèi)聚性(P<0.05)，對其他4種指標無顯著影響。影響酸奶硬度的因素較多，如原料乳成分、牛乳處理方式、酸度等[23]。3組酸奶的原料及加工過程一致，冷藏過程中低劑量組酸奶酸度最小，高劑量組與對照組的酸度酸度偏高。因此酸度可能是影響L.plantarumQ7低劑量組與對照組硬度的差異因素，酸度越小，蛋白質(zhì)水合作用減弱，硬度越小。酸奶硬度決定了酸奶的咀嚼口感[24]，硬度偏小的酸奶口感偏柔軟。酸奶內(nèi)聚性受到酸度、持水性及蛋白結(jié)構(gòu)等因素的影響。接種L.plantarumQ7可能會影響酸奶的酸度和蛋白結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致乳蛋白之間的交互作用及乳凝膠的內(nèi)部鍵加強，因此內(nèi)聚性提高[25]。低劑量L.plantarumQ7組酸奶具有柔軟口感和較強內(nèi)聚性。但L.plantarumQ7對酸奶內(nèi)聚性的影響原因有待進一步探究。

表1 酸奶質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table 1 Results of texture analysis of yoghurt

注：字母不同表示差異顯著，P<0.05

2.3.6 感官鑒評

為研究L.plantarumQ7對酸奶的感官品質(zhì)的影響，對3組酸奶進行感官鑒評，評分結(jié)果如表2所示。L.plantarumQ7低劑量組和高劑量組酸奶的色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)評分均顯著高于對照組，其中低劑量組酸奶感官評分最高，表明低劑量L.plantarumQ7可以使酸奶風(fēng)味更佳，這與低劑量L.plantarumQ7可以延緩后酸化、改善酸奶的質(zhì)構(gòu)的結(jié)果相一致。

表2 酸奶感官鑒評結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of yoghurt

3 結(jié)論

研究了產(chǎn)細菌素L.plantarumQ7對酸奶后酸化及酸奶的質(zhì)構(gòu)、感官品質(zhì)的影響。L.plantarumQ7對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長有一定程度抑制作用，且對后酸化主要產(chǎn)酸菌種保加利亞乳桿菌的抑制作用更強。低劑量L.plantarumQ7不僅可以縮短酸奶發(fā)酵時間，而且在酸奶貯藏期能夠延緩后酸化。低劑量L.plantarumQ7可以顯著降低酸奶硬度，提高酸奶內(nèi)聚性。低劑量L.plantarumQ7組酸奶感官評分和風(fēng)味更佳。上述研究表明，L.plantarumQ7具有作為優(yōu)良酸奶輔助發(fā)酵菌株的開發(fā)前景。