陳斯文 李思放 陳雅南 祁少海 陳 蕾*

(1.中山大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510080；2.中山大學中山醫(yī)學院 臨床醫(yī)學系，廣東 廣州 510080；3.中山大學附屬第一醫(yī)院燒傷外科，廣東 廣州 510080)

各種原因造成的皮膚損傷若波及真皮，修復后易形成瘢痕，不僅會影響外觀、功能，還可導致肢體畸形，給患者及其家人帶來沉重的心理和經(jīng)濟負擔。如何促進此類創(chuàng)面愈合并提高修復質(zhì)量是組織工程學研究的重點。組織工程真皮是一種真皮等同物，對創(chuàng)面起覆蓋保護、防止體液流失等作用之外，還能誘導細胞遷入增殖，為真皮組織再生性修復提供支撐。人源性異體脫細胞真皮經(jīng)脫細胞處理后免疫原性降低，是真皮缺損修復的理想材料，但該產(chǎn)品存在著傳播疾病的潛在危險(如艾滋病)，且隨著器官移植規(guī)范化的推進，來源日益緊張，不能滿足臨床的需要。組織工程真皮產(chǎn)品的研發(fā)為改善創(chuàng)面修復質(zhì)量，解決皮源緊張?zhí)峁┬碌耐緩健Ｄ壳?，國外研究者已成功地開發(fā)出出多款組織工程真皮，初步應用于深度燒傷、糖尿病相關創(chuàng)面的修復及瘢痕整形手術。為了促進組織工程真皮的研發(fā)及臨床轉(zhuǎn)化，建立皮膚創(chuàng)面修復動物模型具有重要意義。

豬的解剖結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)與人十分類似。與大型豬種相比，小型豬體型小、操作方便、易于飼養(yǎng)、飼養(yǎng)費用低、基因純度較高。作為實驗動物在皮膚、燒傷等領域具明顯應用優(yōu)勢。

1 小型豬的皮膚特點

小型豬(以巴馬小型豬為例)的皮膚結(jié)構(gòu)與人皮膚結(jié)構(gòu)一樣，表皮層自內(nèi)向外依次為由基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層組成，而真皮層則由乳頭層和網(wǎng)織層構(gòu)成。表皮中最底層為基底層，附著于基膜上，由一層矮柱狀基底細胞組成。棘層由4～10層多邊形，體積較大的棘細胞組成。顆粒層由1～2層梭形細胞組成。透明層由多層無胞核和細胞器組成。皮膚最外層為角質(zhì)層，由多層扁平的，無細胞核和細胞器的角化細胞構(gòu)成。而真皮靠近表皮的為乳頭層，結(jié)構(gòu)致密，含豐富的毛細血管，有真皮乳頭和表皮皮釘相互連接，結(jié)構(gòu)與人皮膚極為相似。內(nèi)層網(wǎng)織層較厚，內(nèi)有交織成網(wǎng)的膠原纖維和許多彈性纖維以及較多血管、淋巴管、皮脂腺、汗腺和神經(jīng)。兩層交接處有許多水平走向的淺表小靜脈和小動脈從，伸出許多垂直毛細血管營養(yǎng)真皮和表皮。此外，巴馬香豬皮膚真皮基質(zhì)的構(gòu)成成和分布也和人類皮膚極其類似，主要由膠原纖維、彈力纖維及網(wǎng)狀纖維構(gòu)成，但巴馬香豬皮膚真皮層中彈力纖維明顯比人類皮膚中的彈力纖維含量少。值得注意的是，豬的皮膚真皮基質(zhì)中廣泛分布有Langerhans cells等具有免疫活性的細胞2。

巴馬香豬皮膚與人皮膚之間亦存在差異。首先，巴馬香豬皮膚中的汗腺與其它豬種一樣，是頂泌汗腺，分布于真皮和脂肪相接的真皮深層，在頦部、蹄間、包皮開口及乳腺外周較多、分泌物通過接近于毛囊的開口排放于體外3，不能調(diào)節(jié)體溫；而人類則主要是外泌汗腺，只有特殊部位才有頂泌汗腺，人類的汗腺主要起調(diào)節(jié)體溫的作用。其次，巴馬香豬皮膚中的很多物質(zhì)仍然缺乏與人類相對應的抗原決定簇，與相對應的人抗血清之間沒有交叉反應4。

2 小型豬皮膚創(chuàng)面愈合特點

驗證組織工程真皮類材料所用的創(chuàng)面多采用銳性嚙齒類動物如SD大鼠、小鼠由于皮下結(jié)締組織疏松，主要是通過收縮傷口而達到修復創(chuàng)傷目的5。而小型豬的皮膚創(chuàng)面愈合主要是通過創(chuàng)面組織再生及上皮化來完成，過程與人類似。因此，選用小型豬作為組織工程真皮治療效能驗證的載體更具科學性。

3 目前豬在皮膚組織工程中的應用

Yanfu Han6等利用表達VEGF的人臍帶系間葉基質(zhì)細胞與經(jīng)激光打孔的無細胞真皮基質(zhì)構(gòu)建組織工程真皮，并將此真支架植入全層皮膚切除的迷你豬創(chuàng)面上。以此來為構(gòu)建一種新型的皮膚組織工程材料建立構(gòu)想。Daegu Son7等選用Yorkshire豬來探究皮下脂肪對皮膚移植存活基質(zhì)的影響并證明皮下脂肪的存在對皮膚真皮血管再生有正性作用，并發(fā)現(xiàn)一種新的皮膚生長機制。Elizabeth Kiwanuka8等也是選用yorkshire豬來比較skin micrografts，斷層皮片，自體角質(zhì)細胞對創(chuàng)面愈合的治療效能。并得出MV與斷層皮片相對于無材料覆蓋和自體角質(zhì)細胞來說，均對皮膚移植有利的結(jié)論。

4 豬創(chuàng)面修復模型的構(gòu)建

4.1 豬品系的選擇

目前國內(nèi)可供選擇的豬有巴馬小型豬，五指山小型豬、貴州小型香豬、藏豬、西雙版納微型豬、廣西巴馬小型豬等9。其中，五指山小型豬是我國小型豬中體型最小、體重最輕的品種之一，具有體型小、遺傳穩(wěn)定，抗逆性強等優(yōu)勢。但其毛色為黑色，對皮膚愈合情況的觀察有一定影響。貴州小型香豬體型小，品種純。藏豬有生命力強和抗逆性強等優(yōu)點；版納微型豬近交系數(shù)較高，體型矮小，生長緩慢。巴馬小型豬具有遺傳穩(wěn)定，體重較小，除頭部和尾部外，身上絕大部分及毛發(fā)為白色，實驗觀察較為方便等優(yōu)點10。在實驗豬的選擇上，可根據(jù)特定的實驗目的來選擇具體的品系。

目前國內(nèi)在皮膚創(chuàng)面愈合試驗中選用較多的豬種為巴馬小型豬和五指山小型豬。而國外選擇較多的為約克豬，此種豬毛色為白色，體型適中，但國內(nèi)不常用，故不作過多敘述。此外，在豬的年齡選擇方面，通過Federico Solla11等在新生豬身上做同種異體皮膚移植的實驗發(fā)現(xiàn)，年齡過小的豬在免疫耐受方面發(fā)育未成熟，易出現(xiàn)排斥反應，因此建議此類實驗應在體重在2kg以上，出生6天以后的豬身上進行。

4.2 皮膚創(chuàng)面修復模型的構(gòu)建

4.2.1 除毛

除毛建議選擇用電動剃毛刀或者剃須刀，盡量不用脫毛膏，避免脫毛膏刺激皮膚引起皮膚紅熱等現(xiàn)象影響實驗觀察。

4.2.2 消毒

可選用碘仿等消毒劑消毒，不宜選擇刺激性較強的消毒劑消毒。

4.2.3 標記和制造創(chuàng)面

可選用馬克筆或者“紋身”的方式對創(chuàng)緣進行12標記，后者可在豬皮膚長期保留以便觀察創(chuàng)面收縮情況。創(chuàng)面形狀可為圓形或方形，面積從4cm2到25cm2，依實驗需要和豬的皮膚面積而不同，創(chuàng)面間間隔一般設為2cm以上7，11，13。制造的創(chuàng)面深度宜不超過肌肉表面深筋膜，實際深度依實驗要求和豬皮膚厚度而定，如E.Middelkoop1等在建立真皮替代物動物模型時采用20kg的雌性約克豬，取皮深度為2.7mm。

4.2.4 取皮及組織工程真皮植入

取皮方法目前主要有兩種，一種為手術刀取皮7，另一種為電動取皮刀取皮12。手術刀取皮操作簡單，但取皮的厚度不均勻且較為費時。電動取皮刀能獲取厚度均勻(平均能取到0.20～0.30mm的厚度)且更薄的斷層皮片，操作時間短，但對研究者的手術操作能力要求較高。

4.2.5 縫合及包扎

豬有喜歡磨蹭皮膚的習性，因此創(chuàng)面的保護必不可少。目前，較為常用的方案是采用透氣、有彈性的粘性繃帶(Curafix? Lohmann & Rauscher，Neuwied，Germany)和彈性包扎套(Tubigrip)1對實驗豬進行加壓包扎14。操作時需要避免包扎過緊影響豬的呼吸、活動和正常進食。

5 豬創(chuàng)面修復質(zhì)量的評估

5.1 造模后觀察與取材

造模后，如有需要可采用注射鎮(zhèn)痛藥的方式減輕動物的痛苦。有文獻報道，術后連續(xù)注射阿司匹林(10mg/kg)5天可有效緩解動物的術后疼痛15。

操作者可在設定的觀察時間點選用手術刀或Punch biopsies的方法獲取組織。前者取材面積廣，后者所獲組織為直徑小于10mm的固定圓柱形，操作便捷14。必要時，需要將創(chuàng)面組織及其周圍的正常皮膚、皮下組織一同取下，便于對比觀察。

5.2 創(chuàng)面愈合質(zhì)量的常用檢測手段

組織工程真皮材料在實際應用時常需與自體斷層皮片結(jié)合、一期手術移植修復受體創(chuàng)面。其體內(nèi)驗證是否成功可通過評估自體斷層皮片移植成活效果，創(chuàng)面床血管再生、炎癥細胞浸潤、纖維化程度，材料降解情況等而判斷12。下面，作者列舉一些常用的檢測方法供實驗者參考。

5.2.1 數(shù)字化平面幾何法

通過描繪創(chuàng)面大小，并用scion image software等軟件進行分析，得出創(chuàng)面的收縮數(shù)據(jù)8。

5.2.2 病理染色

最常用的染色方式包括蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和Masson染色，前者主要用于固定組織基本形貌觀察，后者主要用于評估組織內(nèi)的膠原沉積(纖維化)情況8。為了對標本組織血管化、炎癥浸潤及瘢痕形成狀況進行突出顯示和重點評估，研究者還引入了免疫組織化學技術。就研究者通常關注的局部血管化和炎癥水平評估來說，目前常用的檢測抗體有人血管內(nèi)皮生長因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)14、白細胞分化抗原31(Cluster of Differentiation 31，CD31)和CD34(CD34是所有新生小血管內(nèi)皮細胞表達的一種特異性抗原，也表達于造血干細胞表面，故可用于標記新生小血管和造血干細胞16)。炎癥水平評估方面，除了經(jīng)常使用白細胞分化抗原68(Cluster of Differentiation 68，CD68)等抗體來標記巨噬細胞等在皮膚創(chuàng)面修復中扮演重要角色的免疫細胞以外，還可檢測白介素10(Interleukin 10，IL-10)(一種抗炎癥反應細胞因子，能減弱中性粒細胞和巨噬細胞的作用。其表達增高說明機體調(diào)節(jié)性地控制炎癥反應的進行，保證炎癥反應不過表達，減少炎癥反應對機體組織的損害17)、C-X-C型趨化因子配體2(CXC motif chemokine ligand 2，CXCL2)(由單核細胞和巨噬細胞分泌產(chǎn)生，具有趨化作用。其通過提高基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的水平募集中性粒細胞和造血干細胞18。此蛋白的表達與炎癥反應程度呈正相關)等炎癥相關因子的表達水平。

5.2.3 基因表達情況分析

目前，與豬相關的研究試劑較少，在進行免疫組化等需抗原抗體反應參與的檢測時困難較大。此時，研究者也可通過核酸檢測技術對創(chuàng)面修復情況進行評估。α1-I型膠原基因(collagen，type I，alpha 1，COL1a1)、COL1a2、COL3a1、COL5a2、腱糖蛋白C(Tenascin-C，TNC)19，20等是常見檢測細胞外基質(zhì)的基因。其他還有重構(gòu)酶(基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，t-PA)、尿激酶型纖溶酶原激活物(urinary-type plasminogen activator，u-PA)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(plasminogen activator urokinase receptor，PLAUR)等)表達水平，炎癥相關細胞因子(C-C型趨化因子配體2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、CXCL2、IL-10)和生長因子(成纖維細胞生長因子7(fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、Smad蛋白-3(Smad3))、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFB1)、TGFB2、TGFB319，21，22-25)的表達以及WNT信號通路的檢測26，27。

5.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

通過激光共聚焦顯微鏡對已作熒光標記的組織切片進行觀察，并利用計算機進行圖像處理，得出細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。除此之外，對較厚的組織切片進行連續(xù)掃描，再經(jīng)過計算機圖像處理，可形成完整的三維圖像，以此獲得較完整的皮膚結(jié)構(gòu)圖像13。

5.2.5 X光

為能夠直觀的觀察血管的再生情況和走向，可拍攝X光片來觀察，步驟如下：在動物處于麻醉的狀態(tài)下，靜脈注射麻藥加肝素使血管擴張，隨后注射生理鹽水與造影劑替代全身血液，最后拍攝X光照片以看血管再生情況7。

5.2.6 多普勒血流檢測

多普勒血流檢測儀可發(fā)射激光達皮下1到1.5mm的深度，此深度的結(jié)構(gòu)為真皮乳頭環(huán)內(nèi)的小動脈，毛細血管，毛細血管后小靜脈以及表面的水平走向的小血管28。運用多普勒血流檢測恩典方法可了解活體情況下動物皮膚的血管再生以及血流的情況。

進行直觀的觀察6。

6 結(jié)論

目前，國內(nèi)可用于組織工程真皮體內(nèi)驗證的小型豬品種較多，皮膚結(jié)構(gòu)、生理功能、免疫及創(chuàng)面愈合過程與人類接近，適用于檢測組織工程真皮。本文回顧了國內(nèi)外現(xiàn)有豬皮膚移植模型的構(gòu)建方法并對其評價指標進行復習。以求供研者根據(jù)不同的實驗目的進行選擇，助力于組織工程真皮的研發(fā)及轉(zhuǎn)化應用。