譚思由，陳文雁，孔高茵，劉景詩，魏 來

（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，長沙 410005）

肝臟缺血再灌注損傷是指肝臟在缺血后恢復(fù)其血流供應(yīng)時，肝細胞的代謝和功能障礙以及細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)損傷較肝臟缺血時更為嚴重的一種現(xiàn)象，是一種常見于外科手術(shù)如肝臟切除術(shù)、肝移植術(shù)后、以及發(fā)生失血性休克和肝臟創(chuàng)傷時的嚴重并發(fā)癥［1-2］。HIRI 可造成肝臟部分切除患者或者肝移植患者肝臟功能的受損和下降，導(dǎo)致手術(shù)失敗甚至患者死亡。有相關(guān)研究顯示針刺具有抗炎、抑制應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)［3-5］，然而電針是否具有防治肝臟缺血再灌注損傷，改善肝臟功能的作用尚不明確，且缺少對刺激穴位選擇的相關(guān)研究。根據(jù)文獻報道和中醫(yī)經(jīng)典理論，肝臟相關(guān)的穴位有肝俞、陽陵泉、太沖、內(nèi)關(guān)等穴，本文旨在中醫(yī)理論指導(dǎo)下探究以上穴位不同的組合對肝臟缺血再灌注損傷發(fā)揮的效應(yīng)，揭示不同的穴位選擇治療效果的差異性，為臨床防治HIRI 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 SPF 級雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量200g±20g（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2015-0013），以上大鼠按照隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組、非經(jīng)非穴組共7 組，每組各10 只，實驗過程嚴格遵照科技部（2006）398 號《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》文件要求執(zhí)行［6］。

1.2 主要儀器和試劑 儀器：SDZ-II 型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），不銹鋼毫針（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品有限公司），AnymicroDSSTM 圖像采集系統(tǒng)，德國LEICARM2245 型石蠟切片機，全自動生化分析儀（siemens 公司，德國）；試劑：蘇木素-伊紅（HE）染色液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），TNF-α、IL-6 檢測試劑盒（北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；藥品：麻醉劑采用濃度為10%水合氯醛溶液（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 各組干預(yù)方法 參照《實驗針灸學(xué)》的標準取穴［8］，肝俞組取大鼠兩側(cè)肝俞穴；肝俞+陽陵泉組取兩側(cè)肝俞和陽陵泉穴；肝俞+內(nèi)關(guān)組取兩側(cè)肝俞和內(nèi)關(guān)穴；肝俞+太沖組取兩側(cè)肝俞和太沖穴；非經(jīng)非穴組取兩側(cè)肝俞穴區(qū)旁開6～8mm 左右的非經(jīng)非穴肌肉結(jié)締組織。固定大鼠后，選用規(guī)格為0.30mm×13mm 的不銹鋼毫針，消毒后將針刺入相應(yīng)穴位（區(qū)域），左右各一對，針刺深度均為5mm。同側(cè)兩根毫針分別連接電子針療儀正負極，接通電源后將波形調(diào)至疏密波，頻率為2/100Hz，強度以能見到針體顫動為宜，干預(yù)時間為30min，干預(yù)結(jié)束后即開始構(gòu)建70%HIRI 模型。

模型組操作見1.4，假手術(shù)組僅行剖腹、肝門暴露1h 后縫合，不行其他任何手法操作。

1.4 70%HIRI 模型的制備 對于模型組、肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組、非經(jīng)非穴組，參照Zabala［7］等方法，大鼠禁食6h，自由飲水，行10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉（350mg/kg）后，固定大鼠、備皮、消毒，于劍突下沿正中線作一約 3cm 切口。暴露肝門后解剖肝十二指腸韌帶，并進一步分離供應(yīng)肝左葉和肝中葉的動脈、靜脈和膽管，然后應(yīng)用無創(chuàng)血管夾阻斷1h，誘發(fā)70%肝臟熱缺血（liver warm ischemia，IWI）。松開血管夾后腹部滴入0.5mL 生理鹽水并縫合腹部切口，4h 后肝臟再灌注完成。成功構(gòu)建70%HIRI 模型后，行大鼠腹主動脈穿刺取血3～4mL 于采血管中，直立靜置30min 后4?C 、1，500 × g 離心20 min，取其上清-20 ?C 保存，同時迅速切取肝臟組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定。

1.5 觀察指標

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 在再灌注4h 后收取各組肝中葉及肝左葉組織標本，放置于10%中性福爾馬林溶液中固定48h，隨后利用蘇木精尹紅（HE）染色光鏡下觀察各組肝臟組織病理形態(tài)，并行肝臟組織病理損傷評分。評分標準為：0 分：靜脈血管及肝小葉內(nèi)無炎性細胞浸潤及肝細胞變性、壞死；1 分：匯管區(qū)少量炎細胞浸潤，肝細胞少量變性及壞死；2 分：肝小葉內(nèi)散在肝細胞變性及灶狀壞死，肝組織內(nèi)較多炎性細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整；3 分：肝竇、肝中央靜脈內(nèi)游血，廣泛肝細胞變性、壞死，肝組織大量炎性細胞浸潤，部分肝小葉破壞［9］。

1.5.2 血清ALT、AST 檢測 在再灌注4h 后從腹主動脈取血3～4mL，所獲取的標本均于24h 內(nèi)利用全自動生化分析儀檢測血清中ALT 和AST 水平。

1.5.3 ELISA 法測定血清TNF-α 和IL-6 水平 TNF-α和IL-6 ELISA 試劑盒購自北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。將目的蛋白單抗包被于酶標板，加入試劑盒內(nèi)抗目的蛋白抗體以及親和素，加顯色底物和終止液，用酶標儀測定450nm 波長下吸光度值，并通過繪制標準曲線計算蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用mean±SD 表示，兩樣本均數(shù)間比較用t 檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組大鼠肝臟組織病理改變及病理損傷評分的比較 病理結(jié)果顯示假手術(shù)組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，匯管區(qū)內(nèi)未見明顯炎癥細胞浸潤，肝竇及肝細胞索結(jié)構(gòu)正常，未見有明顯的肝細胞變性及壞死；模型組肝組織細胞大范圍出血壞死，匯管區(qū)大量炎癥細胞浸潤中央靜脈，肝竇內(nèi)亦有大量炎癥細胞浸潤，大量肝細胞索結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常；其余五組可見部分肝細胞水腫變性、壞死，散在空泡樣變性，肝竇及匯管區(qū)可見少量炎性細胞浸潤，部分肝細胞索結(jié)構(gòu)破壞，見圖1。評分結(jié)果：肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但以上四組各組評分均高于假手術(shù)組（P<0.01），且低于模型組和非經(jīng)非穴組（P<0.01），且模型組和非經(jīng)非穴組損傷評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1H。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理改變（HE，X200）和損傷評分A：假手術(shù)組；B：模型組；C：肝俞組；D：肝俞+陽陵泉組；E：肝俞+內(nèi)關(guān)組；F：肝俞+太沖組； G：非經(jīng)非穴組；H：肝臟組織病理損傷評分

2.2 各組大鼠血清中ALT、AST 水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ALT 和AST 水平明顯升高（P<0.01），電針預(yù)處理后非經(jīng)非穴組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組和非經(jīng)非穴組ALT與AST 水平均高于肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組（P<0.01），各電針組兩兩之間比較，肝俞+陽陵泉組ALT（P<0.05）和AST（P=0.011）水平低于肝俞組，但其余各組之間ALT 和AST 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖2A、B。

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平的比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平明顯升高（P<0.01），經(jīng)電針預(yù)處理后非經(jīng)非穴組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組、肝俞+太沖組TNF-α、IL-6 水平均較模型組和非經(jīng)非穴組降低（P<0.01），各電針組兩兩之間比較，肝俞+陽陵泉組TNF-α（P<0.05）、 IL-6（P<0.05）水平低于肝俞組，其余各組之間ALT 和AST 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見圖2C、D。

圖2 各組大鼠血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6水平比較注：*P<0.05；**P<0.01

3 討論

HIRI 并不局限于肝臟的病理生理過程，而是一個涉及多個組織器官的復(fù)雜的系統(tǒng)過程。HIRI 可嚴重損害肝功能，甚至產(chǎn)生不可逆的損傷，引起多個器官的功能障礙。厭氧代謝、線粒體損傷、氧化應(yīng)激、ROS 分泌、細胞內(nèi)Ca2+超載、中性粒細胞產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子以及NO 等都參與了HIRI 的發(fā)生和發(fā)展［10-11］。

既往研究中，電針能夠改善心、腦、腎等器官的缺血再灌注損傷［12-14］，但目前關(guān)于電針對HIRI 保護性效應(yīng)的研究很少，而且針對于相關(guān)穴位選擇和搭配的研究更加匱乏。在中醫(yī)理論中，肝俞是肝臟的背俞穴，是肝臟之氣輸注于背部的特定穴，有調(diào)整肝臟功能的作用，如《千金方》：肝俞主“積聚病痛，兩脅急痛”；《針灸甲乙經(jīng)》：“肝脹者，肝俞主之，《針灸大全》：“肝俞……五積氣塊，血積業(yè)癖”，等等。太沖是肝經(jīng)的原穴，亦可以治療肝臟的疾病，正如《靈樞·九針十二原》所說：“五臟有疾，當取之十二原”；“五臟有疾也，應(yīng)出十二原”；“陰中之少陽，肝也，其原出于太沖”，按照根結(jié)、標本理論，太沖與肝俞配伍能夠起到治療肝臟疾病，保護肝臟功能的效果。 而陽陵泉是治療膽腑疾病十分有效的穴位，《靈樞·邪氣臟腑病形》中提到：“膽病者，善太息，口苦，嘔吐宿汁，心下潺潺，恐人將捕之，隘中介介然，數(shù)唾……取陽陵泉”，《針灸甲乙經(jīng)》亦云“脅下支滿，嘔吐逆，陽陵泉主之”，此穴與肝俞配伍能起到肝膽同治，發(fā)揮護肝利膽的有益作用。內(nèi)關(guān)穴常常用于主治心痛、驚悸、神昏等，具有醒神定志的功能，其與肝俞穴配伍能起到扶正祛邪，調(diào)和陰陽，疏通經(jīng)絡(luò)，使失調(diào)的氣血津液或臟腑趨向正常狀態(tài)的作用。故而選擇以上所述穴位，以肝俞為主穴，分別配伍太沖、陽陵泉、內(nèi)關(guān)，研究比較三組配穴抗HIRI 的效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示：穴位電針預(yù)刺激具有防治肝臟缺血再灌注損傷的作用，且穴位配伍的不同在防治HIRI 上具有不同的效應(yīng)，通過肝臟缺血前同時刺激肝俞、陽陵泉二穴相對于刺激肝俞+太沖、肝俞+內(nèi)關(guān)和單一刺激肝俞穴可能具有更好的減輕HIRI 的作用。該作用主要體現(xiàn)為：電針預(yù)刺激能夠減輕大鼠缺血再灌注肝臟細胞壞死的嚴重程度；以及能夠減少匯管區(qū)和肝竇內(nèi)炎癥細胞的聚集，保護正常的肝臟組織結(jié)構(gòu)。另外，在肝俞組、肝俞+陽陵泉組、肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組中，各電針穴組的肝臟組織損傷評分差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，而肝俞+陽陵泉組和肝俞組兩組之間比較，前者血清轉(zhuǎn)氨酶和TNF-α、IL-6 水平更低，肝俞組相對于肝俞+內(nèi)關(guān)組和肝俞+太沖組無明顯差異。本結(jié)果一方面說明了轉(zhuǎn)氨酶和相關(guān)血清學(xué)指標也許比肝臟病理損傷評分能更早的提示HIRI 的發(fā)生；另一方面，說明了肝俞穴和陽陵泉穴配伍相對于其它穴位配伍可能具有更好的抗HIRI 效應(yīng)。本團隊在本次結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合既往研究考慮，擴大樣本量和豐富檢測指標的多樣化或許能夠得到更為確切的研究結(jié)果。此外，針對于不同的電針干預(yù)參數(shù)結(jié)合特定穴位是否發(fā)揮了不同的抗肝臟缺血再灌注損傷的作用還有待進一步的研究。

本研究證明了穴位電針預(yù)刺激能夠有效減輕肝門阻斷引起的肝臟缺血再灌注損傷，且該效應(yīng)因配伍穴組的不同而有差異，并證明了肝俞穴與陽陵泉穴配伍相對于單一刺激肝俞穴具有更顯著的作用，但是其內(nèi)在機制仍待進一步研究。本項研究得出的結(jié)果有可能對于進一步探索穴位配伍效應(yīng)的研究模式有一定的啟發(fā)意義，以此來驗證并揭示穴位功能與機體狀態(tài)的相關(guān)規(guī)律，在科學(xué)研究基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化有效的穴位配伍方案，為臨床治療和研究提供依據(jù)。