王朝強 李雪麗 何曉宇 李惠梅 吳李勇 周之平 王 春

福建醫(yī)科大學附屬閩東醫(yī)院，福建福安 355000

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的退行性疾病之一。隨著社會人口老齡化，發(fā)病率逐年增高，嚴重危害人類的健康，同時也對社會經(jīng)濟造成極大的負擔[1]。有研究顯示，中國有癥狀的KOA的患病率為8.1%[2]。骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)楹诵?，累及軟骨下骨，包括滑膜、關(guān)節(jié)及其他結(jié)構(gòu)改變的慢性炎癥[3-4]。骨關(guān)節(jié)炎動物模型是研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制、危險因素及其治療方法的重要手段[5]。目前還缺乏既符合人類關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展特點，又可以為臨床診斷治療提供有力證據(jù)的動物模型[5-7]。本研究采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)Ⅱ型膠原酶注射法及關(guān)節(jié)制動法建立犬KOA動物模型，可作為研究膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的理想動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Beagle犬12只（普通級），均2歲左右，9雌3雄，購于福州振和實驗動物技術(shù)開發(fā)有限公司[許可證編號：SCXK（閩）2012-0001]，比格犬膝關(guān)節(jié)均無明顯異常，精神狀態(tài)良好。本研究符合福建醫(yī)科大學附屬閩東醫(yī)院對研究的相關(guān)倫理要求[批件號：[2019]寧閩醫(yī)倫理審字第（0916-0）號]。

1.1.2 實驗設(shè)備及試劑 GE3.0T 750MR機、柯達750DR機、孝感亞光包埋機、顯微照相機等。高分子石膏，Ⅱ型膠原酶（美侖生物），Ⅳ型膠原蛋白免疫組化試劑盒（武漢博士德）等。

1.2 實驗動物分組

比格犬12只，隨機分為藥物組（Ⅱ型膠原酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射法）和石膏組（關(guān)節(jié)制動法），藥物組犬于關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射4mg/mL的Ⅱ型膠原酶0.1mL，石膏組的實驗犬于關(guān)節(jié)過伸位固定[6-10]。

1.3 檢測方法及病理學檢測

在實驗前及實驗后1、3、6、12周分別行關(guān)節(jié)正側(cè)位X線片、MRI檢查。影像學檢查方法：實驗犬麻醉后仰臥于檢查床，沙袋固定、伸直雙側(cè)下肢，行正側(cè)位照片，同法進行膝關(guān)節(jié)MRI掃描。并于實驗后3、12周將實驗犬分批手術(shù)，切取關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及軟骨下骨組織，行病理學檢查。病理學檢查方法：實驗犬麻醉后切開膝關(guān)節(jié)腔，手術(shù)切取部分滑膜組織，再分別于負重部位切取軟骨面至軟骨下骨柱狀標本，制備成5μm厚的石蠟切片，分別行HE染色、阿利新藍染色、Masson染色及Ⅳ型膠原蛋白免疫組化檢測，光學顯微鏡下觀察。

1.4 觀察指標

觀察的指標包括膝關(guān)節(jié)X線片、MRI檢查結(jié)果、組織病理學檢查等，并以改良Mankin評分標準對關(guān)節(jié)軟骨的病理改變作量化分析[11-12]。

1.5 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，采用配對樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 犬膝關(guān)節(jié)X線

在造模前后比較中，石膏組造模后X線片見關(guān)節(jié)間隙稍變窄、模糊，髁間嵴稍變尖，見唇狀骨質(zhì)增生，髕骨間隙略變窄，藥物組造模后X線片檢查主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄。見圖1、2。

圖1 石膏組X線圖像（1a 固定前、1b 固定后3周、1c 固定后12周）

圖2 藥物組X線影像（2a 藥物注射前、2b 藥物注射后3周、2c 注射后12周）

2.2 犬膝關(guān)節(jié)MRI檢查

在實驗終點犬膝關(guān)節(jié)MRI檢查中，石膏組顯示膝關(guān)節(jié)積液，量較大，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，缺失的最大深度超過50%，部分出現(xiàn)軟骨剝脫，病理分級達到Ⅲ級以上。藥物組提示關(guān)節(jié)積液，相對于石膏組積液量較少，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，缺失的最大深度在50%左右，病理分級也達到Ⅱ級以上。見圖3 ～ 5。

2.3 犬膝關(guān)節(jié)病理學檢查

兩組病理學檢查均出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)炎特征性的病理學改變。早期見關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)變薄，細胞老化、凋亡，藥物組早期病理改變較為明顯，后出現(xiàn)軟骨細胞排列紊亂，潮線上移，然后軟骨表面裂隙、剝脫，細胞成簇生長、甚至出現(xiàn)細胞減少，潮線模糊消失。兩組HE染色均可見染色變深，膠原纖維、細胞老化。Masson染色中見膠原纖維染色變深老化，炎癥浸潤。阿利新藍染色中可見到關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中染色明顯變淺，表面其粘多糖含量減少，在石膏組后期尤為明顯。在Ⅳ型膠原蛋白免疫組化中見斑片狀或團塊狀染色，提示軟骨內(nèi)血管生長并穿入軟骨層。最終石膏組病理分級根據(jù)改良Makin評分以中重度為主，藥物組以輕中度為主。見圖6～9。

圖3 術(shù)前MRI圖像

圖4 石膏組12周MRI影像

圖5 藥物組12周MRI影像

2.3.1 Masson染色

圖6 正常、藥物組及石膏組犬膝關(guān)節(jié)組織Masson染色結(jié)果（×40、×100、×200、×400）

2.3.2 HE染色

圖7 正常、藥物組及石膏組犬膝關(guān)節(jié)組織HE染色結(jié)果（×40、×100、×200、×400）

2.3.3 阿利新藍染色

圖8 正常、藥物組及石膏組犬膝關(guān)節(jié)組織阿利新藍染色結(jié)果（×40、×100、×200、×400）

2.3.4 Ⅳ型膠原蛋白免疫組化

圖9 正常、藥物組及石膏組犬膝關(guān)節(jié)組織Ⅳ型膠原蛋白免疫組化結(jié)果（×40、×100、×200、×400）

表1 兩組犬骨關(guān)節(jié)炎動物模型的改良Makin評分

2.4 兩組犬骨關(guān)節(jié)炎動物模型的改良Makin評分

隨著時間的延長，石膏組的病理改變在實驗3周較輕，后逐漸加重，至12周時發(fā)展為中重度膝關(guān)節(jié)炎。藥物組膝關(guān)節(jié)炎病理改變主要發(fā)生在3周，隨著時間的延長，關(guān)節(jié)炎并未顯著加重。見表1。

3 討論

KOA發(fā)病率高，對生活影響較大。膝關(guān)節(jié)炎的動物模型制備方法主要分為手術(shù)方法及非手術(shù)方法[5，13]。對關(guān)節(jié)炎的檢驗評估方法也較多[14]。本研究采用的Ⅱ型膠原酶注射法及石膏固定法均操作簡單，應(yīng)用多種方法進行綜合評估。Ⅱ型膠原酶注射法能夠在短期內(nèi)造模成功，需要時間較短，一般3周左右即可，延長造模時間對于該動物模型意義不大，主要表現(xiàn)為早中期骨關(guān)節(jié)炎改變。石膏法造模所需時間較長，約12周左右，隨著時間的延長，骨關(guān)節(jié)炎的程度逐漸加重。在造模的不同階段可以顯示不同時期的骨關(guān)節(jié)炎改變，在病理學改變上更加符合骨關(guān)節(jié)炎的病理學特征。

X線片檢查是骨關(guān)節(jié)炎診斷的金標準，但缺乏敏感性[15]。常用于骨關(guān)節(jié)炎動物模型的評估[16]。因X線片對于軟骨組織顯示的欠缺，僅對關(guān)節(jié)間隙及周圍增生骨贅情況的進行評估。本研究中犬膝關(guān)節(jié)X線片檢查不能準確反映關(guān)節(jié)炎的情況，在病理顯示為骨關(guān)節(jié)炎晚期的模型中，其X線仍不典型。因此，X線片可作為診斷標準之一，但尚不足作為一個評判標準。在動物模型的評估中MRI檢查更準確，敏感性高。它不僅顯示關(guān)節(jié)軟骨，對于半月板、韌帶、關(guān)節(jié)滑膜等組織均可以清晰顯示，在骨關(guān)節(jié)炎不同時期均有典型表現(xiàn)[17-18]。將滑膜增厚、軟骨變薄、侵蝕、軟骨下骨病變、關(guān)節(jié)積液等情況直觀的顯示出來。在本研究中，造模12周后藥物組多處于骨關(guān)節(jié)炎早中期，而石膏組多處于中晚期。在MRI圖像上對于早期滑膜的病變、關(guān)節(jié)積液、關(guān)節(jié)軟骨下病變均有清晰的顯示，而在中晚期可以見軟骨變薄、軟骨下骨囊性變等特征性改變。與段鑫等[19]的研究結(jié)果相符。且相對于手術(shù)造模方法，本研究所示的骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)更加符合人退行性骨關(guān)節(jié)炎的特征。病理學檢查作為大多數(shù)疾病診斷的“金標準”，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中得到廣泛的應(yīng)用[20]。病理學檢查可以從細胞層面把軟骨細胞、膠原纖維、黏多糖、潮線、血管長入等改變清楚的呈現(xiàn)出來[21-24]，且對于骨關(guān)節(jié)炎病理學分級分期更靈敏、有效。在本研究的病理學檢查中出現(xiàn)軟骨細胞減少、排列紊亂、成簇生長；膠原纖維染色不均勻且染色變淡；黏多糖減少，尤其是在中重度骨關(guān)節(jié)炎中；潮線的上移、模糊不清、甚至消失；團塊狀的血管長入等，以上這些都是在骨關(guān)節(jié)炎不同時期的典型表現(xiàn)。

KOA的發(fā)病目前認為與軟骨及軟骨下骨的損傷密切相關(guān)[4，25-28]。在本研究中MRI及病理學檢查均發(fā)現(xiàn)軟骨及其周圍的病變。各期關(guān)節(jié)炎的典型表現(xiàn)均可見到。有研究表明關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與血管長入及血管翳形成有關(guān)，而本研究在對血管基質(zhì)的Ⅳ型膠原蛋白染色中也得到了證實[21]。

綜上所述，Ⅱ型膠原酶注射法及石膏固定法均可成功制備犬KOA動物模型。在非手術(shù)方法中較為簡便實用，各有優(yōu)劣，在造模的不同時間段可以表現(xiàn)出不同程度的典型病理形態(tài)。為KOA的發(fā)病機制及診療研究提供了良好的實驗條件，奠定了研究基礎(chǔ)。