何正枝 林 冰 甄錦壯 嚴(yán)紅蓮

廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院 （佛山市順德區(qū)婦幼保健院）生殖科，廣東佛山528300

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中選擇整倍性胚胎移植后即使植入成功也并非都能獲得持續(xù)妊娠，表明胚胎發(fā)育潛力也不能僅通過(guò)染色體的狀態(tài)來(lái)評(píng)估[1]，應(yīng)繼續(xù)探討新的預(yù)測(cè)評(píng)估胚胎發(fā)育潛力指標(biāo)，提早進(jìn)行干預(yù)治療將能改善胚胎結(jié)局。本研究通過(guò)檢測(cè)2018年12月～2020年4月共94例周期患者卵泡液游離DNA（cfDNA）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量與胚胎發(fā)育質(zhì)量的關(guān)系，探討其在預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月～2020年4月在本院接受輔助生殖技術(shù)助孕的94例周期患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）輔助生殖技術(shù)助孕適應(yīng)證為輸卵梗阻/缺如；（2）在研究期間行常規(guī)IVF-ET患者的第一個(gè)周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方取卵日因精液質(zhì)量下降嚴(yán)重、睪丸取精、受精低下等行卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)；（2）取卵日未獲得卵母細(xì)胞；（3）女方有可能影響卵子質(zhì)量的基礎(chǔ)疾病。共納入94例周期患者，年齡23～44歲，按照年齡分組,年齡≥35歲的患者為研究組（n=44），年齡＜35歲的患者為對(duì)照組（n=50）。女性患者卵巢儲(chǔ)備功能基本處于正常范圍，男方精液基本正常。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且與患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 卵泡液收集 取卵日手術(shù)醫(yī)生對(duì)直徑＞17mm的卵泡優(yōu)先進(jìn)行穿刺，將取得的第一管顏色清亮的卵泡液傳遞到胚胎實(shí)驗(yàn)室。撿取卵丘冠復(fù)合物后將卵泡液以3000r/min、10min離心，留取上清液，-80℃保存待檢。

1.2.2 卵泡液cfDNA檢測(cè) 購(gòu)自上海吉泰依科賽生物科技有限公司的EXKubit dsDNA HS分析試劑盒，使用Qubit3.0熒光檢測(cè)儀按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 卵泡液VEGF檢測(cè) 購(gòu)自武漢博士德Human VEGF PicoKine ELISA Kit試劑盒，HR801酶標(biāo)儀讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出的曲線進(jìn)行數(shù)值計(jì)算。

1.2.4 胚胎質(zhì)量參數(shù)收集

1.2.4.1 受精卵觀察 參照 Nasiri[2]的分級(jí)法：根據(jù)卵胞質(zhì)內(nèi)原核數(shù)量、合子中核的位置、大小、排列及核內(nèi)核仁的數(shù)目、大小、分布情況對(duì)受精卵進(jìn)行評(píng)估，依評(píng)估結(jié)果將正常受精卵分為 Z1、Z2、Z3、Z4 四個(gè)等級(jí)。

1.2.4.2 卵裂期胚胎評(píng)分 參照日內(nèi)瓦胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)卵裂球的數(shù)目、均勻程度、形成碎片的多少評(píng)分。

1.2.4.3 囊胚評(píng)分 參照Gardner囊胚分級(jí)法：首先根據(jù)囊腔的擴(kuò)張程度將其分為6期，1期：囊胚腔＜囊胚體積的1/2；2期：囊胚腔＞囊胚體積的1/2；3期：囊胚腔充滿整個(gè)囊胚； 4期：透明帶變薄，囊胚腔擴(kuò)張；5期：正在孵出的囊胚；6 期：完全孵出的囊胚。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分為3個(gè)級(jí)別，A級(jí)：細(xì)胞數(shù)多，細(xì)胞結(jié)合緊密；B級(jí)：細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞結(jié)合較松散；C 級(jí)：細(xì)胞數(shù)極少。滋養(yǎng)層細(xì)胞也分為3個(gè)級(jí)別，A 級(jí)：細(xì)胞數(shù)目多，囊胚四周均有細(xì)胞分布；B 級(jí)：細(xì)胞數(shù)目較少，上皮細(xì)胞較松散；C 級(jí)：細(xì)胞數(shù)目極少。

正常受精率=2PN/獲卵數(shù)×100%、可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%、卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎率=卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%、繼續(xù)培養(yǎng)囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/繼培胚胎數(shù)×100%、優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/繼培胚胎數(shù)×100%。

可利用胚胎定義：培養(yǎng)到第三天時(shí)用于移植、冷凍及胚胎繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育達(dá)到優(yōu)質(zhì)囊胚標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)目總和；卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎定義為：第一天原核評(píng)分為2PN、Z1或2PN、Z2；第二天卵裂球數(shù)為4～5個(gè)，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；第三天卵裂球數(shù)為7～9個(gè)，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；優(yōu)質(zhì)囊胚率定義：根據(jù)囊胚腔的擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)大小及外滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量，評(píng)分達(dá)到3BC/3CB及以上的囊胚。

1.3 胚胎的觀察時(shí)間

1.3.1 卵母細(xì)胞采集 采用常規(guī)促排卵方案，卵泡生長(zhǎng)成熟充分時(shí)，于注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后36～38h在陰道B超介導(dǎo)下穿刺取卵，在體式顯微鏡下從卵泡液中撿取卵丘冠復(fù)合物后轉(zhuǎn)移到二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h。

1.3.2 體外授精 把優(yōu)化處理后的精液按照一定的比例加入到培養(yǎng)皿中進(jìn)行授精操作，于授精后4h拆除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞觀察第二機(jī)體出現(xiàn)率，如果大于30%則為受精成功。

1.3.3 胚胎及囊胚的觀察 受精后的第一天記錄受精卵的原核情況，第2、3天記錄分裂期胚胎情況，培養(yǎng)到第3天將需要行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎轉(zhuǎn)移到專用的囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2～4d，記錄囊胚形成情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（） 表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組間體重指數(shù)（BMI）、促性腺激素（Gn）使用時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不孕年限比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 兩組卵泡液cfDNA、VEGF含量比較

研究組患者cfDNA含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組患者VEGF含量比對(duì)照組有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

組別 BMI（kg/m2）Gn使用時(shí)間（d）不孕年限（年）研究組（n=44） 22.39±3.47 11.68±2.44 4.48±3.94對(duì)照組（n=50） 21.34±3.01 12.34±3.35 3.14±2.22 t 1.571 1.079 2.062 P 0.104 0.332 0.032

表2 兩組患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比較（±s，pg/mL）

表2 兩組患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比較（±s，pg/mL）

組別 cfDNA VEGF研究組（n=44） 27.96±4.43 761.45±436.79對(duì)照組（n=50） 22.14±3.35 671.33±417.22 t 7.225 1.022 P 0.001 0.309

2.3 兩組患者胚胎發(fā)育參數(shù)比較

研究組的繼續(xù)培養(yǎng)囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組正常受精率、可利用胚胎率、卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者胚胎發(fā)育參數(shù)比較 [%（n/n）]

3 討論

外周血cfDNA主要來(lái)源于細(xì)胞的凋亡及壞死，以雙鏈DNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物等形式存在于血液中，大小為150～210000bp不等的片段。1948年Mandel[3]首次在健康人外周血中發(fā)現(xiàn)了游離DNA的存在，由于健康人群自身機(jī)體平衡機(jī)制的作用使其含量維持在較低水平。1997年Lo等[4]首次證實(shí)孕婦血漿（清）中存在游離胎兒DNA并將其應(yīng)用于性連鎖遺傳病中，為產(chǎn)前診斷開(kāi)辟了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷新途徑，隨后在人體其他體液如精液、尿液、腦脊液、卵泡液及囊胚液中均檢測(cè)到cfDNA的存在[5]。Thierry等[6]研究發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA與腫瘤組織DNA的測(cè)序達(dá)96%以上一致，由于腫瘤的異質(zhì)性使其在腫瘤細(xì)胞穿刺過(guò)程或組織活檢中可能只檢測(cè)到部分的亞型，而血漿cfDNA則能全面地檢測(cè)分析出腫瘤的分子亞型。在IVF-ET中卵子質(zhì)量包括卵子完成正常減數(shù)分裂、受精、胚胎生成以及后續(xù)發(fā)育的能力，是胚胎發(fā)育潛能的決定因素，也是影響助孕結(jié)局的主導(dǎo)因素[7]。卵母細(xì)胞在發(fā)育成熟的過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均來(lái)自于卵泡液，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也排泄入卵泡液中[8]。國(guó)內(nèi)外有報(bào)道關(guān)于輔助生殖患者血清及卵泡液中各成分的變化對(duì)臨床結(jié)局的影響，但缺乏對(duì)卵泡液中cfDNA和VEGF含量檢測(cè)對(duì)不同年齡不孕患者胚胎發(fā)育潛力預(yù)測(cè)分析的報(bào)道。本研究中卵泡液cfDNA含量在卵裂期胚胎發(fā)育中未產(chǎn)生明顯影響，但在發(fā)育到囊胚階段就產(chǎn)生較大的影響，并隨著年齡的增長(zhǎng)，卵泡液cfDNA含量增加而囊胚形成的數(shù)量及質(zhì)量明顯下降，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。卵泡液中cfDNA可能是卵母細(xì)胞在發(fā)育成熟過(guò)程中遇到應(yīng)激反應(yīng)或自身新陳代謝異常的產(chǎn)物釋放到卵泡液中，能反映卵子質(zhì)量高低的指標(biāo)之一，在胚胎培養(yǎng)體系中獲得高質(zhì)量的卵子是培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)胚胎的前提條件，給患者帶來(lái)更實(shí)際性的幫助。卵母細(xì)胞是在充滿卵泡液的微環(huán)境中發(fā)育和成熟，研究卵泡液微環(huán)境中各種物質(zhì)及細(xì)胞因子的改變對(duì)卵子質(zhì)量的影響及卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，為了使胚胎體外培養(yǎng)體系更加接近機(jī)體的生理環(huán)境，獲得理想的妊娠結(jié)局。取卵過(guò)程中B超顯示卵泡的直徑不一定與卵子的成熟度相關(guān)，憑主觀上的卵泡直徑大小并不能明確說(shuō)明卵子的成熟度及質(zhì)量高低，如何能快速準(zhǔn)確反映卵母細(xì)胞成熟度及卵子質(zhì)量，對(duì)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力顯得尤為重要，也將成為輔助生殖技術(shù)探索的新方向。王興玲等[9]研究表明cfDNA在預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞成熟度和胚胎質(zhì)量方面的應(yīng)用有很大價(jià)值，研究結(jié)果顯示游離DNA含量與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量有相關(guān)性，使用脫氧核糖核酸酶來(lái)降低cfDNA含量的靶向治療將會(huì)成為治療不孕患者的高效技術(shù)之一。

VEGF是肝素結(jié)合雙鏈糖蛋白，在血管生成、血管通透性、細(xì)胞增殖等方面起著重要作用。曹娟等[10]研究表明，VEGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目增多而加速血管的形成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生蛋白水解酶、組織因子及間質(zhì)膠原酶等改變血管通透性，加快纖維蛋白原及血漿蛋白的外滲導(dǎo)致間質(zhì)水腫、損傷細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。也有研究[11]表明，VEGF參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程。卵泡液中VEGF能夠促進(jìn)卵泡周圍微血管形成，使卵泡從血液中獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟、胚胎的著床提供良好的局部環(huán)境[12]。Konc等[13]研究表明，在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞上和卵泡膜細(xì)胞上的VEGF表達(dá)強(qiáng)度隨著卵泡生長(zhǎng)發(fā)育而增強(qiáng)，排卵前VEGF升高可能反映了顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的增殖和成熟，提示卵泡成熟。目前評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣程度主要參照胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)規(guī)律，建議在觀察胚胎形態(tài)學(xué)變化的基礎(chǔ)上測(cè)定卵泡液中VEGF含量，采取有效的措施降低劣胚形成率。有研究進(jìn)一步表明在卵泡液中加入適量的VEGF而人為改變卵子成長(zhǎng)發(fā)育微環(huán)境，有助于提高胚胎質(zhì)量并提高助孕成功率[14]。本研究中卵泡液VEGF含量在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與所納入例數(shù)有關(guān)但研究組卵泡液VEGF含量稍高于對(duì)照組，研究組的卵裂期胚胎質(zhì)量和對(duì)照組相當(dāng)，但研究組的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率比對(duì)照組差，說(shuō)明卵泡液VEGF促進(jìn)卵泡周圍微血管生成，血管通透性增加從而使卵泡液中含有更多的卵泡刺激素、黃體生成素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作用于卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞，從而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過(guò)度。有研究發(fā)現(xiàn)[15]卵泡液中低VEGF水平的優(yōu)質(zhì)胚胎具有高種植能力而高VEGF含量則預(yù)示胚胎發(fā)育不良。本研究中卵泡液VEGF含量與胚胎發(fā)育潛力是否有相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。

胚胎發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，僅從卵裂期胚胎的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)分來(lái)判斷其發(fā)育潛力還不完全準(zhǔn)確，囊胚培養(yǎng)是衡量體外胚胎發(fā)育潛力的有效方法[16]。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，卵泡液cfDNA含量對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中囊胚的形成及質(zhì)量有著一定的影響，對(duì)不同年齡不孕患者胚胎發(fā)育潛力有預(yù)測(cè)價(jià)值；卵泡液VEGF含量隨著年齡的增長(zhǎng)有所升高，但在兩組不同年齡患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)胚胎發(fā)育質(zhì)量沒(méi)有明顯的影響。目前對(duì)cfDNA、VEGF的檢測(cè)可能受到標(biāo)本來(lái)源和處理辦法、實(shí)驗(yàn)操作及靈敏度等問(wèn)題，還需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的臨床檢測(cè)流程。研究組的促性腺激素總量比對(duì)照組大，可能與患者年齡增大對(duì)藥物的反應(yīng)性降低有關(guān)。為了能更深入探討卵泡液中cfDNA、VEGF含量對(duì)胚胎發(fā)育潛力評(píng)估，還需要大樣本的研究來(lái)論證。