王 嬌，趙 爽，段鑫越，王予頔，秦 莉，安 毅，端正花*

（1.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津 300384；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

苯并 三唑（Benzotriazole，BTR）及 其衍 生 物（BTRs）在醫(yī)藥、農(nóng)藥、材料、生物染色劑和離子受體等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用[1-2]。例如美國每年BTRs的平均總產(chǎn)量高達(dá)9000 t[3]。由于其龐大的生產(chǎn)量及各種消費(fèi)和工業(yè)產(chǎn)品廣泛的使用，BTRs對(duì)環(huán)境的污染日益受到重視。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，美國和東亞地區(qū)的室內(nèi)灰塵總BTRs的濃度大約在20～90 ng·g-1，而中國室內(nèi)灰塵中的濃度最高能達(dá)2000 ng·g-1。世界范圍內(nèi)淡水和海洋環(huán)境中BTRs的總濃度約為0.08～200 μg·L-1[5-6]。含有甲基的BTRs在人體脂肪組織中也被廣泛檢測到[7]。BTRs的急性毒性較低，但是會(huì)產(chǎn)生各種慢性毒性[8]。研究發(fā)現(xiàn)BTR具有發(fā)育毒性、致突變性和內(nèi)分泌干擾特性，被列為環(huán)境可疑致癌物[9-10]。

BTRs芳香環(huán)上的氮硫雜原子上有孤對(duì)電子，易與各種重金屬離子或受體結(jié)合。兩者結(jié)合后的聯(lián)合毒性效果還存在爭議。大部分工作認(rèn)同有機(jī)絡(luò)合可以顯著降低重金屬的毒性，因?yàn)榻饘倥c有機(jī)試劑的絡(luò)合降低了其游離形態(tài)的濃度。如Haghighi等[11]研究發(fā)現(xiàn)天然水體中腐植酸（HA）可降低Cd的毒性。作者前期研究發(fā)現(xiàn)5μmol·L-1苯并三唑在斑馬魚胚胎24 h血液流動(dòng)發(fā)育和56 h死亡率這2項(xiàng)指標(biāo)上都會(huì)顯著降低1μmol·L-1Cd的毒性[12]。另一方面，有機(jī)物與重金屬的螯合作用會(huì)提高重金屬的富集率和生物有效性。陳敏等[13]發(fā)現(xiàn)分子量相對(duì)較小的螯合劑二乙氨基二硫代甲酸鈉（DDTC）與Cd螯合后，會(huì)導(dǎo)致Cd濃度增加，從而能產(chǎn)生各種不良反應(yīng)。

隨著水體和土壤污染問題的日益突出，人們對(duì)污染物引發(fā)的食品安全日趨關(guān)注。當(dāng)前，農(nóng)作物遭受重金屬污染的生理生態(tài)毒性及其治理措施備受重視，重金屬與新興污染物對(duì)農(nóng)作物聯(lián)合毒性的研究已經(jīng)有很多[14]。芥菜型小油菜是我國廣泛食用的常見蔬菜，有研究表明小油菜對(duì)Cd有富集能力，且Cd能夠在小油菜體內(nèi)進(jìn)行遷移[15]。BTR是一種廣泛應(yīng)用的金屬緩蝕劑[16]。盡管這兩種污染物在水體和土壤環(huán)境中經(jīng)常被檢測到，但是它們對(duì)蔬菜的聯(lián)合效應(yīng)還未見報(bào)道。因此，本研究以可食蔬菜上海青小油菜（Brassica campestrisL.）為研究對(duì)象，從小油菜生長狀況、Cd的蓄積以及抗氧化酶和金屬硫蛋白（MT）表達(dá)這3個(gè)方面探討了BTR和重金屬Cd的聯(lián)合毒性效果，并從不同次序聯(lián)合暴露方式下Cd形態(tài)變化的角度分析其聯(lián)合作用機(jī)制，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中BTR存在條件下重金屬對(duì)作物毒性效應(yīng)的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

選用上海青小油菜（Brassica campestrisL.）作為供試植物，種子購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。塑料花盆購自天津市某花卉市場。花盆尺寸為45 cm×20 cm×30 cm。

本試驗(yàn)中氯化鎘（CdCl2）、氯化銀（AgCl）和苯并三唑（1-H-benzotriazole，BTR）為分析純（純度＞99.9%），購于Sigma-Aldrich公司。稱取一定量的粉末溶于重組水中，稀釋到需要的濃度。根據(jù)水體環(huán)境中重金屬的實(shí)際濃度和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)中CdCl2的暴露濃度為0.1、0.5、1.0、5、10 μmol·L-1，BTR的暴露濃度為5 μmol·L-1。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

1.2.1 育苗

挑選籽粒飽滿一致、無蟲害、無破損的種子，用5%H2O2浸泡20 min，然后用去離子水沖洗干凈。將種子整齊地排列在鋪有一層濾紙的托盤中，使每粒種子間保持勻稱的距離，保證與溶液的接觸面積和充足的成長空間，托盤放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中。每日向托盤中加入適量相應(yīng)濃度霍格蘭培養(yǎng)液，保持濃度、濕度等適宜生長的條件穩(wěn)定?；舾裉m培養(yǎng)液成分有NH4NO3（0.71 mmol· L-1）、NaH2PO4（0.32 mmol· L-1）、K2SO4（1.02 mmol· L-1）、Ca（NO3）2（0.5 mmol· L-1）、MgSO4（0.65 mmol·L-1）、MnCl2·4H2O（2 μmol·L-1）、（NH4）6· Mo7O24· 4H2O（0.1 μmol· L-1）、H3BO3（8.5μmol·L-1）、ZnSO4·7H2O（0.1 μmol·L-1）、CuSO4·5H2O（0.2μmol·L-1）和FeCl3（5.8μmol·L-1）。托盤培養(yǎng)一周至幼苗5 cm左右，然后進(jìn)行移栽。選取大小均等的20株幼苗移栽到溫室的花盆中，自然光照下生長，具體如圖1所示。

1.2.2 試驗(yàn)暴露

圖1 試驗(yàn)設(shè)置Figure 1 Experiment setup

為降低無機(jī)陽離子對(duì)Cd離子的潛在影響，暴露試驗(yàn)中培養(yǎng)液濃度稀釋為上述霍格蘭培養(yǎng)液濃度的1/4。試驗(yàn)先進(jìn)行 Cd（0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol·L-1）和BTR（5 μmol·L-1）的單獨(dú)暴露，然后進(jìn)行Cd和BTR的聯(lián)合暴露（Cd濃度為 1μmol·L-1，BTR濃度為5μmol·L-1），每組取3個(gè)花盆作為3個(gè)平行，每盆選取大小均等的20株幼苗進(jìn)行移栽，溫室自然光照下生長。隔天更換溶液。聯(lián)合暴露包含3種次序暴露，具體如表1所示。

1.3 測試指標(biāo)

1.3.1 生長狀況

暴露35 d后，單獨(dú)和聯(lián)合暴露組每組每盆隨機(jī)計(jì)數(shù)10棵小油菜，測定其莖長，計(jì)算3盆的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差值以表征結(jié)果。

1.3.2 Cd含量測定

將采集的每組小油菜用蒸餾水沖洗干凈后放入烘箱中，在105℃殺青30 min、80℃下烘至恒質(zhì)量后研碎。分別稱取0.25 g干質(zhì)量上述樣品，加入混合酸（7 mL 65%～68%的HNO3和2 mL 30%的H2O2）浸泡過夜，轉(zhuǎn)入消解罐中，110℃下消解約7 h，180℃加熱趕酸后取下冷卻，定容至25 mL。用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-OES）測定每組樣品中Cd的濃度。Cd的檢出限為0.002 mg·L-1，加標(biāo)回收率94%～105%。Cd的富集倍數(shù)以蔬菜體內(nèi)的Cd含量（干質(zhì)量）與相應(yīng)的暴露濃度之比表示。

1.3.3 抗氧化酶和金屬硫蛋白的測定

（1）抗氧化酶POD、SOD和CAT的測定

聯(lián)合暴露組隨機(jī)選擇每組每盆3棵油菜，摘取所有葉片，用蒸餾水洗凈后晾干。每組隨機(jī)稱取0.2 g葉片，用剪刀剪碎置于研缽中，加入液氮充分研磨后全部轉(zhuǎn)移至5 mL離心管。加入3.5 mL蛋白質(zhì)提取液（15 mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、25 mL甘油、2 g聚乙烯吡咯烷酮）、4℃條件下3500 r·min-1離心45 min，提取總蛋白。然后按照超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒說明測定相應(yīng)蛋白濃度。

（2）金屬硫蛋白（MT）的測定

聯(lián)合暴露組隨機(jī)選擇每組每盆3棵油菜，摘取所有葉片，用蒸餾水洗凈后晾干。每組隨機(jī)稱取0.2 g葉片，加入液氮充分研磨。取0.6 mL待測樣品溶液于2 mL離心管中，加入0.6 mL甘氨酸緩沖液和0.5 mL 20μg·mL-1AgCl溶液，室溫放置5 min；再加入100 μL血紅蛋白溶液，混合均勻，80℃水浴加熱5 min，然后冰浴5 min。室溫條件下，12 000 r·min-1離心 5 min，取上清液；再加100μL血紅蛋白溶液重復(fù)提取1次。合并上清液并用5 mL HNO3（65%～68%HNO3）消解，用ICP-OES測定每組樣品中銀離子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示；組間用Student-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd單獨(dú)暴露

2.1.1 Cd對(duì)小油菜的生長影響

小油菜暴露35 d后，其生長狀況如圖2所示?？梢?，空白對(duì)照組的小油菜生長較好，莖葉平均長度為21 cm。相對(duì)空白對(duì)照組，0.1μmol·L-1Cd暴露對(duì)小油菜的生長有著顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），莖葉平均長度為25.33 cm，莖葉增長率為20.63%，即低濃度Cd會(huì)對(duì)小油菜產(chǎn)生刺激效應(yīng)。當(dāng)Cd的暴露濃度增加到0.5μmol·L-1以上時(shí)，顯著抑制了小油菜莖葉的生長，并且劑量-抑制效應(yīng)關(guān)系顯著（R2=0.779）。

2.1.2 Cd在小油菜中的蓄積

小油菜暴露35 d后，不同暴露劑量下小油菜中Cd的含量如圖3所示。可見，空白對(duì)照組中小油菜中的Cd未檢出。隨著Cd暴露劑量增大，小油菜體內(nèi)Cd蓄積濃度也增大，劑量-蓄積效應(yīng)關(guān)系顯著（R2=0.931）。當(dāng) Cd暴露濃度從 0.1 μmol·L-1增加至 10μmol·L-1時(shí)，小油菜組織中的Cd 蓄積量由11.05 mg·kg-1增加到 223.22 mg·kg-1，增加了約20倍。但是從蓄積倍數(shù)這個(gè)指標(biāo)來看，最低暴露濃度0.1μmol·L-1時(shí)，蓄積倍數(shù)最大，約為110.47。當(dāng)暴露濃度增大到0.5μmol·L-1以上時(shí)，蓄積逐漸飽和，蓄積倍數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=0.917）。即小油菜在低濃度Cd暴露下刺激吸收、高濃度Cd暴露時(shí)抑制吸收。

表1 暴露設(shè)置Table 1 Exposure setup

圖2 不同濃度CdCl2作用下小油菜的莖葉長度Figure 2 The stemlength of the rapes affected by different concentrations of CdCl2

圖3 不同濃度CdCl2作用下小油菜中Cd的蓄積Figure 3 The Cd bioaccumulation in the rapes affected by different concentrations of CdCl2

2.2 Cd與BTR聯(lián)合暴露

2.2.1 小油菜生長狀況

圖4 Cd與BTR聯(lián)合作用下小油菜的莖葉長度和Cd的蓄積Figure 4 The stemlength and Cd bioaccumulation in BTRand Cd joint exposureto the rapes

Cd與BTR聯(lián)合暴露35 d后，小油菜莖葉長度如圖4所示。5μmol·L-1BTR暴露組莖葉平均長度為20.05 cm，與空白對(duì)照組相比無明顯變化（P＞0.05），因此BTR對(duì)小油菜的生長發(fā)育無顯著影響。1μmol·L-1Cd單獨(dú)暴露下小油菜植株顯著變矮（P＜0.01），莖葉長度為17.1 cm。聯(lián)合暴露組中，Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd各組的莖葉長度分別為18.1、18.6、16.9 cm，即Meantime、Cd/BTR這兩種暴露次序能降低Cd對(duì)小油菜的生長抑制（P＜0.01），而BTR/Cd組降低Cd對(duì)小油菜的生長抑制效果不顯著（P＞0.05）。積

2.2.2 Cd在小油菜中的蓄積

如圖4所示，空白對(duì)照組和BTR單獨(dú)暴露組小油菜中的Cd未檢出。不同次序聯(lián)合暴露改變了Cd在小油菜中的蓄積。Cd單獨(dú)、Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd各組中Cd的含量分別為24.09、20.86、21.50、24.51 mg·kg-1。即Meantime、Cd/BTR組能降低Cd在小油菜中的蓄積（P＜0.01），而BTR/Cd組卻不能（P＞0.05）。2.2.3 Cd與BTR聯(lián)合暴露對(duì)小油菜體內(nèi)酶活的影響

試驗(yàn)選擇了SOD、CAT和POD這3種典型的抗氧化酶和金屬硫蛋白MT為研究對(duì)象，以探討不同次序聯(lián)合暴露毒性差異的機(jī)制。如圖5所示，5μmol·L-1BTR對(duì)小油菜產(chǎn)生了一定的氧化性壓力，表現(xiàn)在SOD酶的表達(dá)顯著受到抑制、含量相對(duì)空白對(duì)照組降低了7.67%（P＜0.01），但是CAT和POD的表達(dá)都無顯著變化（P＞0.05）。1μmol·L-1Cd單獨(dú)暴露下小油菜SOD、CAT酶表達(dá)受到抑制，含量相對(duì)空白對(duì)照組分別降低了28.39%（P＜0.01）和65.46%（P＜0.05），POD酶含量卻升高了24.84%（P＜0.01），證明1 μmol·L-1Cd對(duì)小油菜產(chǎn)生更為顯著的氧化性壓力。

圖5 BTR和Cd聯(lián)合暴露中抗氧化酶的表達(dá)和MT含量的變化Figure 5 The changes of anti-oxidative enzyme expressions and MTcontent in the rapes induced by BTRand Cd joint exposure

Cd與BTR不同次序聯(lián)合暴露對(duì)小油菜抗氧化酶的表達(dá)存在差異。與Cd單獨(dú)暴露組相比，Meantime暴露下SOD和POD的表達(dá)都顯著降低（P＜0.01），Cd/BTR暴露只有POD酶表達(dá)的抑制有所降低（P＜0.05），而BTR/Cd暴露下3種抗氧化酶表達(dá)的影響都無明顯差異（P＞0.05）。因此，Cd與BTR不同次序聯(lián)合暴露中，Meantime暴露對(duì)Cd造成的氧化壓力的降低作用最大，BTR/Cd對(duì)Cd造成的氧化壓力的降低作用最小。

Cd與BTR不同次序聯(lián)合暴露對(duì)小油菜MT蛋白的表達(dá)也存在差異。1μmol·L-1Cd單獨(dú)暴露下小油菜MT的表達(dá)量為8.30 mg·kg-1，相對(duì)空白對(duì)照組增加了的 84.44%（P＜0.01）。Meantime、Cd/BTR、BTR/Cd次序聯(lián)合暴露中，小油菜葉片中MT的表達(dá)量分別為5.52、6.10、6.50 mg·kg-1。因此，Meantime暴露對(duì)Cd誘導(dǎo)MT的抑制作用最大，BTR/Cd暴露對(duì)Cd誘導(dǎo)MT的抑制作用最小。

3 討論

鑒于BTRs在水環(huán)境中的高溶解度（28 g·L-1），和大量暴露且穩(wěn)定性較高、難降解，BTRs將會(huì)在水環(huán)境中將會(huì)長期存在。雖然BTRs的水生生物毒性引起了極大的關(guān)注[17]，但是其對(duì)水生生物（綠藻、大型蚤、斑馬魚等）的急性毒性效應(yīng)報(bào)道卻很少[18]，研究的濃度范圍為μmol·L-1級(jí)。BTR在可直接食用農(nóng)作物的蓄積和毒性作用也鮮有報(bào)道。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)500μmol·L-1BTR能夠在水稻幼苗中進(jìn)行蓄積，并且根部的蓄積量顯著高于莖葉，但是BTR對(duì)水稻幼苗的生長沒有影響。因此，BTRs在農(nóng)業(yè)環(huán)境中是以低毒的形式存在的。氧化性壓力[19-20]的誘導(dǎo)一直被認(rèn)為是重金屬在生物體內(nèi)產(chǎn)生毒性作用機(jī)制的重要組成部分。本研究中也發(fā)現(xiàn)5μmol·L-1BTR能夠誘導(dǎo)小油菜SOD酶的表達(dá)，表現(xiàn)出一定氧化性壓力損傷，但是從小油菜的生長狀況來看無顯著毒性效應(yīng)（圖4）。

水體和土壤環(huán)境中重金屬的有效態(tài)以可溶無機(jī)離子態(tài)和離子可交換態(tài)存在。一方面，pH可能是控制土壤中重金屬有效態(tài)的主要因素[21]。冉洪珍等[22]發(fā)現(xiàn)石灰單施及石灰與有機(jī)肥配施均能顯著提高稻田土壤pH值，降低土壤中有效態(tài)Cd的含量和水稻各部位Cd的含量，從而降低Cd對(duì)水稻的毒性作用。另一方面，環(huán)境中有機(jī)質(zhì)的存在可以改變環(huán)境中重金屬的有效態(tài)，使得重金屬向植物根系的擴(kuò)散速度等方面受到影響。段明夢等[23]發(fā)現(xiàn)土壤中易降解有機(jī)質(zhì)中的有機(jī)配位體和Cd2+的絡(luò)合作用增加了有效態(tài)Cd的含量，并進(jìn)一步促進(jìn)了高粱地上部對(duì)Cd的積累。尹炳奎等[24]在研究中表明，土壤有機(jī)物料的降解產(chǎn)物可以顯著增加土壤溶液中可溶性有機(jī)碳（DOC）濃度，改變重金屬在其固液相的分布，影響重金屬在土壤中的吸附，從而影響重金屬的生物有效性。Grüter等[25]報(bào)道長期施用有機(jī)質(zhì)也會(huì)降低小麥中Cd的濃度。

本研究發(fā)現(xiàn)，BTR和Cd同時(shí)加入的方式能夠降低Cd在小油菜中的蓄積及其對(duì)小油菜的毒性效應(yīng)，表現(xiàn)為Meantime組中Cd對(duì)小油菜的生長發(fā)育以及SOD、POD和MT表達(dá)的抑制作用都顯著降低（P＜0.01）。本試驗(yàn)對(duì)暴露系列的pH值進(jìn)行了測定，Cd單獨(dú)及和BTR聯(lián)合暴露的pH值均為6.5左右。前期研究中分析了不同pH值下，Cd和BTR同時(shí)暴露且Cd∶BTR=1∶5時(shí)水溶液中Cd的離子形態(tài)[15]，Cd單獨(dú)暴露組中Cd的形態(tài)為100%的Cd2+，而Meantime組中Cd的形態(tài)為 90% 的 Cd（BTR-）2和 10% 的 Cd2+，因此Meantime聯(lián)合暴露組中Cd2+的濃度相對(duì)單獨(dú)暴露組顯著降低，從而使Cd進(jìn)入小油菜時(shí)的離子有效態(tài)降低，導(dǎo)致聯(lián)合暴露組中小油菜Cd的蓄積量減低（圖4），最終使得該組中Cd對(duì)抗氧化酶和MT的影響都顯著降低（圖5）。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，暴露次序?qū)τ诼?lián)合作用效果有重要意義。3種暴露次序中，BTR對(duì)Cd在小油菜中的蓄積和毒性的降低表現(xiàn)為Meantime組＞Cd/BTR組＞BTR/Cd組。Cd/BTR這種暴露次序中BTR對(duì)Cd在小油菜中的蓄積和毒性的影響略低于Meantime組，表現(xiàn)為與Cd單獨(dú)暴露組相比，Cd/BTR暴露只有POD酶表達(dá)的抑制有所降低（P＜0.05）。推測Cd/BTR組中，除了預(yù)先Cd暴露產(chǎn)生的蓄積和毒性效應(yīng)以外，后期聯(lián)合作用效果與Meantime組類似，在溶液中也主要形成了Cd（BTR-）2，影響了Cd的生物有效性，抑制Cd從溶液中向小油菜根系的傳遞，從而最終導(dǎo)致小油菜莖葉中Cd的含量相對(duì)降低。但是，BTR/Cd這種暴露次序與其他兩者卻截然不同。BTR/Cd組中BTR不能降低Cd在小油菜中的蓄積。究其原因，BTR主要是在植物的根部蓄積[16]，一方面，預(yù)先暴露的BTR在小油菜根部蓄積后，能夠促進(jìn)Cd在小油菜根系的累積。Liu等[16]也證實(shí)了預(yù)先暴露BTR能夠促進(jìn)Cd在水稻根系的累積；另一方面，溶液中也會(huì)形成一定量的Cd（BTR-）2，使得溶液中能夠被根部BTR促進(jìn)吸收的Cd的總量降低。這兩種效果復(fù)合起來，最終使得BTR/Cd組中Cd的蓄積量與Cd單獨(dú)暴露組相比無顯著差異。作者前期在Cd和BTR對(duì)斑馬魚肝臟的聯(lián)合毒性研究中也發(fā)現(xiàn)，Meantime這種暴露方式能夠顯著降低Cd在斑馬魚肝臟中的蓄積，而BTR/Cd這種聯(lián)合暴露方式卻不能[26]。

農(nóng)田重金屬的聯(lián)合毒性作用效果不僅要考慮自然環(huán)境因素的影響，還要考慮由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程由于灌溉、施肥、翻耕所帶來的污染物的不同次序暴露的影響。但是目前暴露順序?qū)χ参镂罩亟饘俚挠绊懙南嚓P(guān)研究仍然有限。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)先加入銅后加入多溴二苯醚的暴露次序中，由于銅對(duì)玉米根細(xì)胞膜的預(yù)先損傷作用，更多的多溴二苯醚會(huì)滲入玉米根系，并在芽中向上移位。

4 結(jié)論

（1）5μmol·L-1BTR雖能夠誘導(dǎo)小油菜SOD酶的表達(dá)，但是對(duì)小油菜最終的生長狀況無顯著毒性效應(yīng)。

（2）BTR能夠降低Cd在小油菜中的蓄積及毒性效應(yīng)，但是暴露次序的改變對(duì)聯(lián)合暴露毒性效果有顯著影響。