龐雅湘，韓 華，殷 玥，馬國華，牛洪琳

(1.河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050031；2.河北省人民醫(yī)院婦一科，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心顯微鏡室，河北 石家莊 050017；4.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長18～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過靶向作用于靶基因的3′非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，包括阻止靶基因的翻譯及加速靶基因的降解。miRNA參與了腫瘤發(fā)展的各個(gè)過程，包括細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、代謝和發(fā)育。miR-140-5p參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，在多種癌癥中發(fā)揮著抗腫瘤作用，但其在前列腺癌中的表達(dá)及作用尚無相關(guān)研究。本研究檢測miR-140-5p在前列腺細(xì)胞株中的表達(dá)，探討其生物學(xué)功能，旨在為臨床治療前列腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) PC3細(xì)胞、DU145細(xì)胞、RWPE-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有雙抗(青霉素和鏈霉素)及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，293A細(xì)胞培養(yǎng)在含有雙抗(青霉素和鏈霉素)及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。每1～2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)80%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。根據(jù)細(xì)胞密度分裝到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；胎牛血清(CLARK Bioscience公司)；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒(上海貝博生物)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司)；miRNA提取試劑盒(Omega 公司)；miRNA反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒(廣州富能基因)；核酸定量儀(德國Eppendorf公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7500 Fast(美國ABI公司)。

1.3引物設(shè)計(jì)及模擬物/抑制物的合成 miR-140-5p及U6上游引物及購自廣州富能基因；miR-140-5p模擬物及抑制物購自上海吉瑪公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine 2000對細(xì)胞轉(zhuǎn)染，PC3細(xì)胞接種到6孔板或96孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長密度為60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)首先應(yīng)用無菌DEPC水將miR-140-p模擬物或抑制物進(jìn)行溶解，并定容為50 pmol/mL。用無血清RPMI 1640分別稀釋模擬物/抑制物以及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑常溫放置5 min。隨后將含有模擬物/抑制物以及Lipofectamine 2000的RPMI 1640充分混合，常溫靜置15 min。其間將PC3細(xì)胞用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次去除血清對轉(zhuǎn)染的干擾，后用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行換液，并將上述混合模擬物/抑制物以及Lipofectamine 2000的RPMI 1640培養(yǎng)基加入孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，棄去孔板中的培養(yǎng)基，更換為新的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步聚合酶鏈反應(yīng)。

1.4.2CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制率 將PC3細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105cells/mL，取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，并按“1.4.1”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后0，12，24，48 h進(jìn)行CCK8檢測，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。檢測前每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀測定各個(gè)孔在450 nm處的光密度(optical density，OD)值，并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4.3流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡 PC3細(xì)胞按“1.4.1”項(xiàng)下轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物及抑制物48 h，收集細(xì)胞；PBS洗滌細(xì)胞；加入100 μL 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI染色混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前，補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。隨后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.4miRNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR PC3細(xì)胞、DU145細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞提取RNA。用于反轉(zhuǎn)錄的總RNA提取方法按照OMEGA miRNA Kit試劑盒提取說明進(jìn)行。Nanodrop核酸定量儀檢測RNA純度和濃度，符合濃度及純度的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。miRNA反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用GeneCopoeia公司All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，取1～2 μg總RNA按說明書建立25 μg反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。按照GeneCopoeia公司miRNA qPCR Kit試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)。以管家基因U6為內(nèi)參，采用△Ct(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進(jìn)行相對定量分析，以2-△△Ct作為目的RNA的相對表達(dá)量。

1.4.5TCGA數(shù)據(jù)庫分析 利用可視化TCGA數(shù)據(jù)庫分析網(wǎng)站oncolnc(www.oncolnc.org)分析miR-140-5p在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，cutoff值選取為-25%～+25%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-140-5p在不同細(xì)胞株中的表達(dá)情況比較 miR-140-5p在DU145及PC3細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于RWPE-1細(xì)胞，miR-140-5p在PC3細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于DU145細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故選取PC3細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。見表1。

表1 不同細(xì)胞株中miR-140-5p相對表達(dá)量Table 1 Relative miR-140-5p expression level in different cell lines

*P值<0.05與RWPE-1比較 #P值<0.05與PC3比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.2轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物能增加PC3細(xì)胞中miR-140-5p表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物的PC3細(xì)胞中miR-140-5p相對表達(dá)量明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)miR-140-5p模擬物轉(zhuǎn)染效率高。見表2。

2.3過表達(dá)miR-140-5p抑制PC3細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡 miR-140-5p的模擬物轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞48 h，過表達(dá)組細(xì)胞增殖率低于陰性對照組，凋亡率高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明過表達(dá)miR-140-5p可抑制PC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。見表3。

表2 轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物對PC3細(xì)胞中miR-140-5p相對表達(dá)量影響Table 2 Relative miR-140-5p expression level in PC3 cells after transfection with miR-140-5p mimic

表3 轉(zhuǎn)染miR-140-5p模擬物對PC3細(xì)胞增殖及凋亡影響Table 3 Effect on cell viability and apoptosis after transfection with miR-140-5p mimic

2.4轉(zhuǎn)染miR-140-5p抑制物能敲低PC3細(xì)胞中miR-140-5p表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-140-5p抑制物的PC3細(xì)胞中miR-140-5p相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)miR-140-5p抑制物敲低效率高。見表4。

表4 轉(zhuǎn)染miR-140-5p抑制物對PC3細(xì)胞中miR-140-5p相對表達(dá)量影響Table 4 Relative miR-140-5p expression level after tranfection with miR-140-5p inhibitor

2.5敲低miR-140-5p表達(dá)促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖抑制凋亡 敲低miR-140-5p表達(dá)組細(xì)胞增殖率明顯高于陰性對照組，凋亡率明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明敲低miR-140-5p表達(dá)可促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。見表5。

組別增殖率凋亡率陰性對照組79.51±4.1211.24±1.14敲低組 87.27±6.457.41±1.01t值89.819119.239P值0.0000.000

2.6低表達(dá)miR-140-5p和前列腺癌患者預(yù)后不良的相關(guān)性 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析86例前列腺癌患者miR-140-5p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示低表達(dá)miR-140-5p組患者(n=43)總生存率低于高表達(dá)miR-140-5p組患者(n=43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。

3 討 論

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全美國前列腺癌新增發(fā)病人數(shù)位居癌癥發(fā)病率首位，死亡人數(shù)排名第二[1-2]。我國前列腺癌的發(fā)病率和檢出率也呈逐年升高趨勢，已位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位[3]。隨著前列腺特異性抗原篩查和手術(shù)進(jìn)步以及放化療技術(shù)、去雄激素治療的進(jìn)展，前列腺癌患者的5年存活率明顯提高。但超過50%患者出現(xiàn)去勢治療抵抗、化療耐藥，進(jìn)而出現(xiàn)疾病進(jìn)展復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及浸潤，威脅患者生命[4]。因此，進(jìn)一步研究前列腺癌發(fā)病機(jī)制，有助于尋找更多的治療方法。

miRNA，作為重要的非編碼RNA，通過靶向結(jié)合在靶基因3′非編碼區(qū)，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解劑抑制靶基因翻譯，發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[5]。miRNA參與了多種疾病(包括心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及腫瘤)的發(fā)生發(fā)展[6]。已有研究證實(shí)，miRNA參與了前列腺癌發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程，包括增殖、遷移、侵襲、凋亡等[7]，如在前列腺癌組織中miR-100表達(dá)量明顯降低，在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-100后，可通過靶向抑制AGO2基因表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。Gao等[9]證實(shí)，miR-323在前列腺癌中高表達(dá)，過表達(dá)miR-323能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞等增殖及進(jìn)展。Hao等[10]發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)miR-211/SPARC 通路可能在前列腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，miRNA可能作為生物學(xué)分子標(biāo)記物與前列腺癌的耐藥及預(yù)后密切相關(guān)。羅振國等[11]比較了前列腺癌患者與前列腺增生患者血清中的miR-107水平，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-107可作為前列腺癌的特異指標(biāo)。Tinay等[12]分析了miR-345-5p在前列腺癌患者血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-345-5p與前列腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，其原因可能與miR-345-5p靶向抑制CDKN1A表達(dá)、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在前列腺癌細(xì)胞中，miR-140-5p表達(dá)明顯降低，通過分析TCGA數(shù)據(jù)可也可得知，前列腺癌患者低表達(dá)miR-140-5p預(yù)后不良，故miR-140-5p可能作為潛在的分子生物學(xué)預(yù)后指標(biāo)在前列腺癌評價(jià)中應(yīng)用。

miR-140-5p在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因作用，并可能與患者預(yù)后相關(guān)。如miR-140-5p在子宮頸癌中表達(dá)降低[13]；miR-140-5p在食管癌中低表達(dá)，并參與了食管癌的侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]；miR-140-5p在胃癌中表達(dá)降低，并且與胃癌患者生存可能存在關(guān)系[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-140-5p在前列腺癌中低表達(dá)，并與前列腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。

一個(gè)miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)一個(gè)基因受到多種miRNA調(diào)控。miR-140-5p在不同癌癥細(xì)胞中的作用也不盡相同。miR-140-5p通過靶向作用于YES1基因，參與了胃癌的遷移及侵襲等惡性過程[16]；另外，在卵巢癌中，過表達(dá)miR-140-5p可明顯靶向作用于PGDFA 3′非編碼區(qū)，抑制其蛋白等表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞等增殖[17]；miR-140-5p還能通過靶向抑制VEGF-A等表達(dá)，調(diào)控非小細(xì)胞肺癌等癌癥進(jìn)展[18-19]。本研究結(jié)果顯示，在PC3細(xì)胞中過表達(dá)miR-140-5p，能夠明顯促進(jìn)PC3細(xì)胞凋亡，抑制其增殖；而敲低miR-140-5p，能促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。但miR-140-5p下游基因及進(jìn)一步調(diào)控機(jī)制，還需要更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，miR-140-5p在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，過表達(dá)miR-140-5p能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，低表達(dá)miR-140-5p與前列腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，這為臨床治療前列腺癌提供了新的思路。