王 鳴 孫梯業(yè)

胃癌是我國較常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，由于缺乏有效的治療手段，嚴重威脅著患者的生命安全。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內胃癌在惡性腫瘤中排名第五，但在癌癥相關死亡中排名第三[2]。由于早期胃癌診斷率較低，許多患者就診時已經(jīng)是中晚期。目前手術結合化療的傳統(tǒng)治療手段預后較差，因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)適用于胃癌患者的分子診斷和治療新靶標。

6-磷酸果糖-2-激酶/2，6-二磷果糖酸酶4(PFKFB4)催化合成2，6-二磷酸果糖，2，6-二磷酸果糖作為一種重要的磷酸糖代謝產(chǎn)物參與糖酵解途徑。目前對于PFKFB4的研究更多側重于其在腫瘤中通過調節(jié)糖代謝來控制腫瘤的生長[3]。近期在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)PFKFB4能夠通過對SCR-3(Steroid receptor coactivator-3，又被稱為NCOA3)的磷酸化提高SRC-3的轉錄活性，進而啟動下游相關基因的表達，促進乳腺癌的惡化和轉移[4]。有研究表明，在胃癌細胞中PFKFB4基因及蛋白的表達水平均明顯升高。但目前對于其在胃癌中的作用研究仍然局限于低氧環(huán)境下的糖代謝過程[5]。本研究檢測了胃癌細胞中能夠與PFKFB4有相互作用的SRC家族(p160/Steroid receptor coactivator family)蛋白，利用轉錄組學尋找SRC蛋白的下游調控基因LKB1(Liver kinase B1，也被稱為STK11)，并進一步研究這一調控路徑在胃癌轉移及惡化中的功能，以期為胃癌的治療提供新的分子靶標及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系

將凍存的人胃癌細胞系MNK45從液氮中取出，置于37℃水浴中迅速溶解，解凍后細胞離心去除凍存液。離心的細胞轉移至裝有10% FBS、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

siSRC-2+S698WT 載體購自Origene，siSRC-2+S698A定點突變序列為：siSRC-2+S698A F：5′-GGACAGCaagTCCCCTGTGGA-3′，R：5′-CAGGGGActtGCTGTCCTGCA-3′，使用Hieff MutTMSite-Directed Mutagenesis Kit 定點突變試劑盒，將Ser698突變?yōu)锳sp698。

本研究中所用引物序列分別為：

PFKFB4-F：5′-CGATACCTGAACTGGATTGGT-3′，PFKFB4-R：5′-GGCACACTGCTTCCTGATTT-3′；SRC-2-R：5′-GGACCTGGTAAGAAGGTGTATTCAG-3′，SRC-2-F：5′-TGCCTCTTAGCATAGGACACAGA-3′；LKB1-F，5′-GCCGGGACTGACGTGTAGA-3′，LKB1-R：5′-CCCAAAAGGAAGGGAAAAACC-3′；ACTB-F：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，ACTB-R：5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。 文中所用抗體除anti-pSRC-2(Ser469)、anti-pSRC-2(Ser487)和anti-pSRC-2(Ser493)，所用肽段序列參照文獻[7]自行制備外，其余抗體購自Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫共沉淀 (0.5～1)×107個MNK45細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，0.25%胰酶消化后PBS再洗3次。加入1 mL含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液，4℃放置45 min，12 000 rpm 4℃離心10 min，收集上清液，加入抗體，4℃孵育過夜；再與預處理后的Protein A瓊脂糖珠在4℃條件下孵育過夜。孵育結束后，用IP裂解液清洗5～7次，最后用Western blot法分析結果。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉染 人胃癌細胞系MNK45待細胞達到80%～90%進行傳代，取3-5代進行實驗。使用Lipofectamine 2 000進行轉染MNK45細胞，將序列(5′-CACTTGTATGGTCCTGT-3′)轉染MNK45細胞獲得siPFKFB4組細胞；將序列(5′-GGGCTGTTAACATTAGCAA-3′)轉染MNK45細胞獲得siSRC-2細胞組[3]；將序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)轉染MNK45細胞獲得NC siRNA細胞組[6]；將購自Origene的LKB1過表達載體轉染MNK45細胞獲得OE LKB1細胞組，轉染后培養(yǎng)48 h和72 h取細胞進行試驗。轉染siSRC-2序列24 h后，將載體siSRC-2+S698WT和siSRC-2+S698A分別轉染至siSRC-2組細胞，獲得siSRC-2野生型互補siSRC-2+S698WT組細胞及siSRC-2Ser6987突變互補siSRC-2+S698A組細胞(Ser6987突變?yōu)锳sp698)。

1.2.3 實驗分組 實驗分為6組：NC siRNA組(干擾對照組)、siPFKFB4組(PFKFB4干擾組)、siSRC-2組(SRC-2干擾組)、OE LKB1組(過表達LKB1組)、siSRC-2+S698WT組(野生型SRC-2互補組)及siSRC-2+S698A組(Ser698位點突變的SRC-2互補組)。

1.2.4 轉錄組學分析 用TRIzol提取siSRC-2組和NC siRNA組細胞的總RNA，利用Qubit 3.0進行RNA定量，Agilent 2100生物分析儀評估RNA提取質量，樣品檢驗合格后測序，進行文庫構建。獲取原始序列后對比人類基因組序列進行MAP和比對，通過RPKM值估算基因表達量，獲得兩組細胞的差異表達基因。

1.2.5 qRT-PCR 檢測PFKFB4、SRC-2和LKB1在MNK45細胞中的表達，采用TRIzol試劑提取總RNA，利用SuperScriptase II試劑盒反轉錄合成cDNA。qRT-PCR的步驟同文獻所述[4]。通過實時檢測PCR擴增，選擇β-actin為內參基因，每個樣品做三個重復，用2-ΔΔCt法對樣本基因進行表達差異相對定量分析，在擴增的指數(shù)期起始模板進行定量。

1.2.6 蛋白免疫印跡 采用Western blot的方法檢測MNK45細胞中PFKFB4、LKB1、SRC-2的蛋白量及SRC-2蛋白磷酸化程度。利用含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液裂解細胞，在4℃下13 000 rpm離心12 min并收集上清液。利用BCA法進行蛋白定量，蛋白變性后上樣，電泳分離使用濕轉法轉膜。室溫5%～10%脫脂奶粉封閉后，在4℃分別與一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h，在膜上滴加ECL化學發(fā)光底物曝光，用紅外成像檢測蛋白印跡帶，以β-actin為內參，用“Quantity one”對條帶灰度值定量?？贵w使用濃度分別為：anti-β-actin(1∶5 000)，anti-PFKFB4(1∶1 000)，anti-SRC-2(1∶2 000)，anti-LKB1(1∶1 000)，anti-pSRC-2(Ser736)(1∶800)，anti-pSRC-2(Ser698)(1∶1 000)，anti-pSRC-2(Ser469)(1∶500)，anti-pSRC-2(Ser487)(1∶750)，anti-pSRC-2(Ser493)(1∶500)。

1.2.7 細胞遷移實驗 將Transwell培養(yǎng)池放入24孔板中，上室分別加入100 μL稀釋好的NC siRNA組、siPFKFB4組、siSRC-2組及OE LKB1組對數(shù)生長期細胞懸液，上述處理后的4組細胞分別接種3～5個小室，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)池，倒去培養(yǎng)基，擦去下室內表面未穿膜的細胞，用甲醇固定15 min，加入染色液DAPI室溫染色10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡拍照。

1.2.8 細胞侵襲實驗 取上述處理后的4組細胞在60 μL的Matrigel加入300 μL無血清培養(yǎng)基中，4℃混勻，加至Transwell小室，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4～5 h至培養(yǎng)基凝固，剩余步驟同遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，兩組以上獨立樣本比較采用方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 與PFKFB4有相互作用的SRC家族蛋白的檢測

SRC家族包含三個成員，分別為SRC-1、SRC-2和SRC-3，本研究通過免疫共沉淀方法能夠檢測在胃癌細胞MNK45中與PFKFB4相互作用的SRC蛋白。結果顯示只有SRC-2與PFKFB4有明顯的相互作用(圖1)。

圖1 CO-IP檢測MNK45細胞中與PFKFB4有相互作用的SRC家族蛋白Figure 1 The SRCs protein interact with PFKFB4 in MNK45 cells by CO-IP

2.2 PFKFB4對SCR-2表達的影響

Western blot檢測NC siRNA組和siPFKFB4組細胞中PFKFB4和SRC-2蛋白表達情況。統(tǒng)計學分析表明SRC-2蛋白(圖2A)和mRNA(圖2B)的表達量在兩組細胞中沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明下調PFKFB4并不影響SRC-2的表達。

2.3 PFKFB4磷酸化SRC-2的檢測

有文獻表明與轉錄有關的SRC-2磷酸化位點有Ser469、Ser487、Ser493、Ser698及Ser736[7-9]，因此本研究分別用帶有上述磷酸化位點的抗體檢測PFKFB4對SRC-2的磷酸化作用，同時檢測其磷酸化位點。結果顯示盡管SRC-2的表達不受PFKFB4的影響，但PFKFB4能夠磷酸化SRC-2的Ser698位點，Ser698的磷酸化程度隨PFKFB4表達量降低而降低(圖3)。

圖2 PFKFB4對SRC-2表達的影響Figure 2 Effect of PFKFB4 on the expression of SRC-2 at levels of protein and mRNA in MNK45 cellsNote：***P<0.001，when compare with the NC siRNA group.

圖3 PFKFB4對SRC-2的磷酸化作用及位點檢測Figure 3 PFKFB4 was detected phosphorylated sites of SRC-2 in MNK45 cells

2.4 SRC-2磷酸化對LKB1基因表達的影響

利用轉錄組學分析NC siRNA組和siSRC-2組差異表達mRNA的情況，圖4A展示了10個表達差異變化最大的基因，其中LKB1的表達水平在siSCR-2組變化最為明顯。用qRT-PCR進行驗證，發(fā)現(xiàn)LKB1的mRNA表達與轉錄組學結果一致且差異最為明顯(圖4B)。為檢測是SRC-2表達量不同還是磷酸化差異對LKB1的表達產(chǎn)生了影響，本研究在siSRC-2組細胞中轉入能表達野生型Ser698的siSRC-2+S698WT回補質粒和Ser698位點突變的siSRC-2+S698A質粒，并檢測這兩組細胞中LKB1蛋白和mRNA的表達，與NC siRNA組及siSRC-2組進行比較，發(fā)現(xiàn)只有siSRC-2+S698WT組細胞的LKB1才能恢復到NC siRNA的表達水平，而Ser698位點突變的siSRC-2+S698A組細胞中LKB1的表達顯著高于NC siRNA，與siSRC-2組細胞持平(圖4C、D)。

2.5 MNK45細胞遷移和侵襲能力檢測

利用Transwell實驗檢測各組胃癌細胞MNK45的遷移和侵襲能力。與NC siRNA組相比，siPFKFB4組、siSRC-2組和OE LKB1組細胞的遷移和侵襲能力受到了顯著的抑制(利用SLD方法進行組間分析，α=0.05)(圖5)。

圖4 SRC-2對LKB1表達的影響Figure 4 Effects of SRC-2 on the expression of LKB1 gene at levels of mRNA and proteinNote：*P<0.05，**P<0.01，when compared with the NC group.# P<0.05，when compared with siSRC-2 group.

圖5 Transwell實驗檢測MNK45細胞遷移和侵襲能力Figure 5 Effects of PFKFB4 on migration and invasion of MNK45 cellsNote：A.The cells of migration or invasion were observed under a fluorescence microscope；B.Statistical results of migration were analyzed in MNK45 cells.

3 討論

PFKFB4基因編碼6-磷酸果糖-2-激酶/2，6-二磷果糖酸酶4(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase 4)，能夠催化合成2，6-二磷酸果糖，2，6-二磷酸果糖作為一種重要的磷酸糖代謝產(chǎn)物參與糖酵解途徑。PFKFB4基因最初發(fā)現(xiàn)于人的睪丸中，在特定時間內參與精子的成熟過程[10-11]，隨后發(fā)現(xiàn)它在多個器官的正常組織中亦有表達[12-13]。2018年，Dasgupta等[4]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，PFKFB4能夠磷酸化SRC-3的S857位點，從而提高SRC-3的轉錄活性。由此我們認識到PFKFB4除作為關鍵成員參與腫瘤細胞的厭氧糖代謝外，還是一個重要的磷酸激酶，能夠提高轉錄因子的活性，在癌細胞的轉移和惡化過程中發(fā)揮作用。有研究表明，PFKFB4在胃癌細胞中高表達[3]。在胃癌細胞中闡明PFKFB4是否會發(fā)揮與其在乳腺癌細胞中類似的功能，激活SRC家族蛋白，從而促進胃癌的轉移及惡化具有重要的意義。

SRC家族是第一個被鑒定的核受體輔激活子[14-17]，有三個轉錄調控因子，分別為SRC-1(NCOA-1，RIP160[18])，SRC-2(NCOA-2，TIF-2，GRIP-1[19-20])和SRC-3(NCOA-3，AIB-1，TRAM-1，pCIP[21-23])。SRC能夠通過二級協(xié)同蛋白增強下游靶基因的轉錄[18]，SRC具有復雜的結構域，它們的功能通過被包括磷酸化在內轉錄后翻譯所調節(jié)和擴展[24]。SRC-1參與胃癌細胞的遷移和侵襲的信號通路，且SRC-1低表達患者預后及五年生存期明顯低于高表達患者[25]，而SRC-3在多種癌癥細胞中高表達，并促進腫瘤的發(fā)生、細胞增殖和轉移[26]。SRC-2作為核受體的轉錄輔激活子，在不同的生理過程中發(fā)揮著多種作用，包括細胞生長、能量代謝、晝夜節(jié)律、進食行為和心臟功能[27-31]。有研究表明SRC-2是前列腺癌的關鍵致癌基因，在轉移性前列腺腫瘤中，SRC-2基因的擴增、過表達和突變水平能夠升高38%[32]，且SRC-2的表達水平與前列腺腫瘤細胞增殖及疾病復發(fā)呈正相關[33]。在乳腺癌細胞中，SRC-2可以通過正向調控MAPK/ERK途徑促進癌細胞的生長[6]。而SRC-2在胃癌中的作用以及其與PFKFB4的關系未見報道，在本研究中我們通過免疫共沉淀的方法確定在胃癌細胞中PFKFB4與SRC-2有相互作用，并進一步發(fā)現(xiàn)PFKFB4能夠磷酸化SRC-2的Ser698位點。

為明確SRC-2磷酸化在胃癌細胞中的作用，本研究首先對siSRC-2組和NC siRNA組細胞進行了轉錄組測序。通過分析差異表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)下調SRC-2表達后，LKB1(Liver kinase B1，也被稱為STK11)的mRNA表達顯著上調。LKB1是腫瘤抑制因子，能夠抑制多種腫瘤細胞的發(fā)展和進展[34]。為證實這一結果，利用Western blot和qRT-PCR檢測了LKB1在siSRC-2組中蛋白和mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)SRC-2表達降低后，LKB1的表達顯著增加。為證實LKB1的表達與SRC-2 Ser698磷酸化的關系，將攜帶野生型SRC-2及Ser698位點突變的SRC-2 cDNA全長的質粒轉染進siSRC-2組，得到siSRC-2+S698WT細胞組和siSRC-2+S698A細胞組，并檢測LKB1在這些細胞中的表達，結果表明只有siSRC-2+S698WT組的LKB1表達量恢復到NC siRNA組的水平。

綜上所述，在胃癌細胞MNK45中，PFKFB4能夠磷酸化轉錄輔因子SRC-2的Ser698位點，從而提高SRC-2的轉錄活性，抑制抑癌基因LKB1的表達，從而保證胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。我們的研究表明，PFKFB4-SRC-2可能可以作為潛在的靶標，在胃癌的靶向治療中發(fā)揮作用。