曾 理 莊樹彤 丁世華 陳 沖 焦 璐 孫大勇

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國呈逐年上升趨勢[1]。CRC患者生存時間取決于患者首次診斷CRC時所處的臨床分期。研究提示CRC患者5年總生存率從I期超過90%下降至Ⅳ期不足10%[2]。因此，輔助臨床早期診斷的標(biāo)志物在CRC診斷和治療中具有重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt幾乎不參與編碼蛋白的RNA。研究顯示，lncRNA在多種癌癥的病理發(fā)展和預(yù)后中起著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA的異常表達與疾病，特別是腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。研究報道，肌動蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1(Actin filament-associatedprotein1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)在食管癌、食管腺癌和鼻咽癌中高表達，與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后不良密切相關(guān)，有望作為癌癥治療的潛在靶點[5-6]。也有文獻證明，AFAP1-AS1高表達可促進CRC細胞的生長和遷移，但具體機制尚不清楚[7]。因此，本研究集中研究lncRNA AFAP1-AS1，探討其在CRC發(fā)展和進展中的作用，期望為AFAP1-AS1作為CRC臨床診治輔助標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CRC糞便樣本

收集2014年7月—2018年6月深圳市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科及胃腸外科診治的38例未經(jīng)手術(shù)，但病理檢測明確診斷為CRC患者的糞便(1～2 g/例)，38例經(jīng)胃腸鏡及其他影像學(xué)、實驗、物理學(xué)檢查確診為正常人群的糞便(1～2 g/例)，所有新鮮糞便置于-80℃保存。所有參與者均簽署知情同意書。有家族性腺瘤型息肉病、家族性非息肉性CRC、結(jié)腸手術(shù)史以及CRC手術(shù)前輔助治療史、急性感染性腹瀉的患者標(biāo)本不予采集。

1.2 細胞培養(yǎng)

正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460、CRC細胞株SW620和HCT116購自中國科學(xué)院上海細胞庫。NCM460用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，SW620和HCT116用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，細胞置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 主要實驗試劑和儀器

RNA提取試劑盒(日本Takara公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Ki和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測試劑盒SYBRTMGreen PCR Master Mix(日本Takara公司)，糞便RNA提取試劑盒(上海晶曠生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000和RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，一抗anti-Cleased caspase 3，anti-Bax，anti-Bcl-2，anti-p-AKT，anti-AKT，anti-PTEN和anti-β-actin(美國CST公司)，二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國Alpha innotech公司)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.4 總RNA提取和Real-time PCR檢測糞便或細胞中AFAP1-AS1的表達

分別取38例CRC患者和38例正常人糞便0.5 g/例，采用Takara的糞便RNA提取試劑盒提取糞便中的總RNA，具體操作參照試劑盒說明書。此外，利用TRIzol試劑提取細胞內(nèi)總RNA，用DNaseI處理，然后用RNeasy kit純化處理后的總RNA。最終將提取的RNA溶解于無RNAase水中。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，Nanodrop檢測RNA濃度。取2 μg上述提取RNA(糞便RNA或細胞RNA)按照反轉(zhuǎn)試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Ki的說明步驟合成cDNA作為之后Real time-PCR反應(yīng)體系的模板。PCR反應(yīng)體系為25 μL，條件為：95℃、2 min，(95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s；40個循環(huán))，72℃、5 min。每個樣品設(shè)3個平行復(fù)孔，所有樣品重復(fù)檢測3次。用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量，β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

以AFAP1-AS1為靶點的小干擾RNA(siRNA)抑制AFAP1-AS1的表達，Invitrogen提供陰性對照siRNA(si-NC)。根據(jù)Lipofectamine 2000的使用說明，對培養(yǎng)在六孔板中的SW620和HCT116細胞轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1或si-NC，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。si-AFAP1-AS1序列為5′-GGGCTTCAATTTACAAGCATT-3′；對照序列si-NC：5′-CCTATCTGGTCAACACGTATT-3′。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.6 MTT法測定CRC細胞株增殖

按照5×103/孔的細胞密度，正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460和CRC細胞株SW620、HCT116接種于96孔板培養(yǎng)，以及si-AFAP1-AS1和siNC分別轉(zhuǎn)染細胞，并于24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTT溶液(1.5 g/L)，置于37℃培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀上490 nm處讀取每孔的OD值，繪制細胞生長曲線。

1.7 蛋白提取和免疫印跡

SW620和HCT116細胞轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1或si-NC 48 h后，RIPA裂解細胞，4℃離心10 min，取上清液定量樣品蛋白濃度。進行10%SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后加入Cleaved caspase 3、Bcl-2、Bax、p-AKT、總AKT、PTEN和β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，次日TBST漂洗三次，每次10 min，然后加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔(或鼠)二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。ECL顯影，Image J分析條帶灰度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測糞便中AFAF1-AS1的表達

通過Real-time PCR檢測AFAP1-AS1在38例CRC患者和38例正常人糞便中的表達水平。結(jié)果表明CRC患者糞便中AFAP1-AS1的表達量為21.53±8.58，正常人糞便中AFAP1-AS1的表達量為2.74±1.23。與正常人相比，CRC患者糞便中AFAP1-AS1表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測CRC患者和正常人群糞便中AFAP1-AS1的表達Figure 1 AFAP1-AS1 of CRC patients and healthy people in feces was detected by Real time-PCRNote：***P<0.001，when compared with the healthy people.

2.2 正常結(jié)腸上皮細胞株和CRC細胞株中AFAP1-AS1的表達情況

為了進一步驗證AFAP1-AS1在CRC中的調(diào)控作用，我們檢測了CRC細胞株SW620和HCT116以及正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460中AFAP1-AS1的表達。結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細胞株相比，CRC細胞中AFAP1-AS1的水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

圖2 在CRC細胞中AFAP1-AS1的表達情況(n=3)Figure 2 The expression of AFAP1-AS1 was detected in NCM460，SW620 and HCT116 cells(n=3)Note: **P<0.01，***P<0.001，when compared with the NCM460 cells.

2.3 si-AFAP1-AS1干擾對細胞增殖的影響

為了研究AFAP1-AS1在CRC中的分子作用機制，我們利用si-AFAP1-AS1干擾AFAP1-AS1的表達。結(jié)果表明，si-AFAP1-AS1可以顯著下降SW620和HCT116細胞中AFAP1-AS1的表達，證明si-AFAP1-AS1轉(zhuǎn)染成功(P<0.01)(圖3A)。為了確定AFAP1-AS1對SW620和HCT116細胞增殖的影響，利用MTT實驗測定轉(zhuǎn)染si-NC或si-AFAP1-AS1后SW620和HCT116細胞的存活率(圖3B)。與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1后，SW620和HCT116細胞的增值速率均顯著降低(P<0.01)，說明下調(diào)AFAP1-AS1表達可以抑制上述細胞系的增殖。

圖3 si-AFAP1-AS1干擾對CRC細胞增殖的影響(n=3)Figure 3 The effect of si-AFAP1-AS1 on proliferation of SW620 and HCT116 cells(n=3)Note：A.The effect of si-AFAP1-AS1 on the expression of AFAP1-AS1；B.Cell viability was detected in SW620 and HCT116cells after transfected with si-AFAP1-AS1.**P<0.01，***P<0.001，when compared with the si-NC group.

2.4 AFAP1-AS1通過內(nèi)在途徑抑制CRC細胞死亡

為了檢測AFAP1-AS1調(diào)節(jié)SW620和HCT116細胞死亡的分子機制，用Western blot檢測Cleaved caspase 3的表達，與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1后，SW620和HCT116細胞中Cleaved caspase 3表達升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4A)。此外，我們還檢測了Bcl-2和Bax的表達，與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1的SW620和HCT116細胞中Bcl-2蛋白水平降低(P<0.001)，Bax表達增加(P<0.05)(圖4B)。以上數(shù)據(jù)表明，si-AFAP1-AS1干擾可誘導(dǎo)內(nèi)源性SW620和HCT116細胞凋亡。

圖4 AFAP1-AS1敲低通過內(nèi)源性途徑增加CRC細胞凋亡(n=3)Figure 4 si-AFAP1-AS1 increased the expression of cleaved-caspase-3，Bax and Bcl-2 protein in SW620 and HCT116 cells(n=3)Note：A.The effect of si-AFAP1-AS1 on the expression of cleaved-caspase-3 in SW620 and HCT116 cells；B.The effect of si-AFAP1-AS1 on the expression of Bcl-2 and Bax in SW620 and HCT116 cells.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the si-NC group.

2.5 AFAP1-AS1通過PTEN/P-AKT調(diào)控細胞增殖

為了檢測AFAP1-AS1調(diào)控SW620和HCT116細胞增殖的分子機制，用Western blot檢測p-AKT和總AKT的表達。與轉(zhuǎn)染si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1降低了SW620和HCT116細胞中p-AKT/AKT的蛋白比值(P<0.01)。此外，si-AFAP1-AS1干擾也誘導(dǎo)了SW620和HCT116細胞中PTEN高表達(P<0.01)(圖5)。

圖5 AFAP1-AS1敲低對PTEN/p-AKT信號通路表達的影響(n=3)Figure 5 The effect of si-AFAP1-AS1 on the PTEN/p-AKT signaling pathway(n=3)Note: **P<0.01，***P<0.001，when compared with the si-NC group.

3 討論

CRC是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，進展快，確診時多數(shù)已進入中晚期。因此，尋找CRC特異性的分子靶點，可能會成為對CRC早期診斷、判斷治療效果、預(yù)后評價等的一種經(jīng)濟而有效的方法。lncRNA是一類長度超過200 nt、缺乏開放閱讀框的非編碼RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種腫瘤中表達失調(diào)，有希望成為新型腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療的靶點，在腫瘤診斷和治療方面顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。同miRNA相似，lncRNA也與靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)功能，即不僅調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育、代謝和凋亡的正常生理過程，而且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。全基因組轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在癌癥中異常表達或失調(diào)，并以各種調(diào)控方式參與腫瘤的代謝，從而影響了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。在CRC的研究中，越來越多發(fā)揮重要作用的lncRNA也相繼被發(fā)現(xiàn)，它們的異常表達，往往發(fā)揮著潛在的促癌或抑癌的作用，且多數(shù)具有較高的特異性和敏感性。因此，lncRNA有望作為腫瘤診斷標(biāo)志物和治療干預(yù)的新靶點。

糞便中脫落細胞反映了結(jié)腸粘膜上皮細胞的增殖和分化，可為CRC的早期發(fā)現(xiàn)提供重要線索，因此，糞便中l(wèi)ncRNA的表達異?？赡苁荂RC早期診斷的新靶點。本研究通過提取確診為CRC患者的糞便與正常人糞便的總RNA，采用Real-time PCR方法檢測AFAP1-AS1的表達水平。結(jié)果顯示，AFAP1-AS1在CRC患者糞便中的表達水平顯著高于正常人糞便，提示AFAP1-AS1的異常表達可能與CRC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；糞便中檢測到AFAP1-AS1表達異常，進一步說明AFAP1-AS1可能是CRC早期無創(chuàng)診斷的特異性檢測指標(biāo)。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)，為了進一步了解這一差異性表達的lncRNA在CRC中的生物學(xué)作用，我們設(shè)計了一段干擾AFAP1-AS1的siRNA序列，將其轉(zhuǎn)染至CRC細胞SW620和HCT116中，MTT法檢測干擾AFAP1-AS1表達對于CRC細胞增殖的影響。MTT結(jié)果顯示，si-AFAP1-AS1轉(zhuǎn)染CRC細胞可顯著降低其增殖速率，說明AFAP1-AS1的表達下調(diào)能夠抑制CRC細胞增殖，其在CRC中的高表達有可能發(fā)揮著潛在的促癌作用，這與王峰等的研究一致[8]。已知PTEN是一種腫瘤抑制基因，可以下調(diào)AKT信號傳導(dǎo)[9]。在多種癌癥中，PTEN/AKT信號傳導(dǎo)被頻繁激活[10]。為了進一步闡明AFAP1-AS1在CRC發(fā)展過程中的分子機制，我們研究了轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1后，PTEN/p-AKT的CRC細胞中的表達情況。實驗結(jié)果證實，si-AFAP1-AS1干擾降低了p-AKT的蛋白水平，并增加PTEN的表達，表明AFAP1-AS1通過調(diào)節(jié)PTEN/p-AKT信號調(diào)節(jié)CRC細胞增殖。

眾所周知，Bcl家族蛋白在調(diào)節(jié)細胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵作用，其中，Bcl-2的是抗細胞凋亡蛋白，Bax可促進細胞凋亡[11]。此外，也有幾種典型的與細胞凋亡相關(guān)的信號通路，如caspase家族通路[12]。因此，為了闡明導(dǎo)致細胞凋亡的潛在靶點，我們探索了si-AFAP1-AS1干擾對Cleaved caspase 3，Bcl-2和Bax表達的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-AFAP1-AS1可增強CRC細胞內(nèi)Cleaved caspase 3和Bax表達，下調(diào)Bcl-2的蛋白水平。這些數(shù)據(jù)表明，si-AFAP1-AS1干擾可誘導(dǎo)SW620和HCT116細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡。

綜上所述，本研究在CRC糞便中檢測并發(fā)現(xiàn)lncRNA AFAP1-AS1表達上調(diào)，并且體外實驗證明，在CRC細胞中干擾AFAP1-AS1表達水平能夠顯著抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，表明AFAP1-AS1高表達很可能與CRC的發(fā)展密切相關(guān)。由此，AFAP1-AS1可能是CRC發(fā)生發(fā)展中的重要靶標(biāo)，可以作為潛在的標(biāo)志分子輔助CRC早期診斷和判斷預(yù)后復(fù)發(fā)。