李宏偉，宋麗莉，張 翼，董澤飛

(1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，河北 邢臺(tái) 054000；2.河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室，河北 石家莊 050017)

大量研究表明[1]，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)具有明顯的心血管保護(hù)效應(yīng)。我們以往的研究顯示[2]，CIHH 對(duì)于缺血/再灌注引起的大鼠心肌損傷具有明顯的對(duì)抗作用。例如，CIHH 具有抗心律失常作用，并可促進(jìn)心臟缺血/再灌注后心功能的恢復(fù)。CIHH 這種心臟保護(hù)作用可維持兩周左右時(shí)間，其機(jī)制可能與心肌抗氧化能力增強(qiáng)[3]、KATP通道的開(kāi)放[4]、熱休克蛋白表達(dá)增強(qiáng)[5]、線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放抑制有關(guān)。此外，在自發(fā)性高血壓、腎血管性高血壓或代謝綜合征大鼠模型，CIHH 處理可明顯降低升高的動(dòng)脈血壓。CIHH 這種抗高血壓作用可能與動(dòng)脈血管的舒張?jiān)鰪?qiáng)，以及壓力感受性反射的易化有關(guān)。但 CIHH 對(duì)心血管功能的保護(hù)作用機(jī)制遠(yuǎn)未完全闡明。

眾所周知，發(fā)育的幼年動(dòng)物與成年動(dòng)物在形態(tài)與功能各方面均表現(xiàn)出明顯差異，并且隨著動(dòng)物年齡的增加，動(dòng)物的大部分生理、生化指標(biāo)都會(huì)發(fā)生改變[6]，例如動(dòng)物功能、神經(jīng)可塑性、對(duì)低氧的反應(yīng)性等方面[7]。我們以往研究顯示，相同程度的 CIHH 處理對(duì)不同年齡大鼠可引起完全不同的作用。在成年大鼠，應(yīng)用 4～6 周、每日 6 h、模擬 5 km 高原的 CIHH 處理可產(chǎn)生心臟保護(hù)效應(yīng)，但對(duì)幼年大鼠則引起心臟損傷，而 4～6 周、每日 5 h、模擬 3 km 高原的 CIHH 可使幼年大鼠出現(xiàn)心臟保護(hù)作用[8]。這說(shuō)明發(fā)育大鼠與成年大鼠對(duì) CIHH 處理的反應(yīng)性是不同的。同樣，在成年大鼠和成年腎血管性高血壓大鼠，我們發(fā)現(xiàn) CIHH 可增強(qiáng)胸主動(dòng)脈環(huán)舒張，但不知 CIHH 對(duì)發(fā)育幼年大鼠胸主動(dòng)脈舒張作用如何。本研究旨在探討 CIHH 處理對(duì)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能的影響及其機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑苯腎上腺素(phenylephrine, PE)(貨號(hào)：P0398)，乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)(貨號(hào)：A2661)，吲哚美辛(indomethacin, Indo)(貨號(hào)：I7378)，格列苯脲(glibenclamide, Gli)(貨號(hào)：G0639)，以上藥物購(gòu)自Sigma公司；四甲基哌啶氧化物(tetramethylpiperidinooxy, Tempo)(貨號(hào)：ALX-430-081-G001)，購(gòu)自Alexis公司。藥物保存在 -20 ℃，使用藥物時(shí)，用二甲基亞砜配制 Gli，用蒸餾水配制其余藥物，用 K-H 液稀釋成浴槽所需濃度，所有藥物及液體都現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 溶液K-H 液(mmol·L-1)：NaCl 118.0、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、NaHCO325.0、KH2PO41.2、glucose 11.0，pH 7.4。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和間歇性低氧處理本研究中對(duì)動(dòng)物的處置均參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用、操作流程均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)所用 Sprague-Dawlay 大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，♂，體質(zhì)量(150～360) g，合格證號(hào)：708068，許可證號(hào)：SCXK(冀)2003-1-003。新生 Sprague-Dawlay ♂大鼠隨機(jī)分為 8 組：CIHH 處理組(CIHH)、CIHH 后1周組(CIHH-p1)、CIHH 后2周組(CIHH-p2)、CIHH 后3周組(CIHH-p3)、對(duì)照組(Con)、對(duì)照一周組(Con-1)、對(duì)照兩周組(Con-2)與對(duì)照三周組(Con-3)。CIHH 各組動(dòng)物從出生前 1～3 d開(kāi)始，隨母鼠一起置于低壓氧艙內(nèi)，接受每天5 h，模擬海拔 3 km 的低壓低氧處理，共 42 d。對(duì)照組動(dòng)物除不接受低壓低氧處理外，其余與 CIHH 處理組動(dòng)物相同。每周定時(shí)記錄動(dòng)物體質(zhì)量及一般狀況。

2.2 離體動(dòng)脈環(huán)制備動(dòng)物麻醉使用戊巴比妥鈉，腹腔注射法(50 mg·kg-1)。麻醉后，取出胸主動(dòng)脈，置于 K-H 液中，剪成動(dòng)脈環(huán)(長(zhǎng)約 3 mm)。將動(dòng)脈環(huán)用細(xì)不銹鋼絲(0.1 mm)穿起，浸泡在恒溫浴槽內(nèi)(成都儀器廠，浴槽內(nèi)有 5 mL K-H 液，溫度保持在 37 ℃，持續(xù)通入 95% O2和 5% CO2混合氣)，將動(dòng)脈環(huán)一端和張力換能器相連，利用 BL-420E+ 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，記錄標(biāo)本的張力變化。

2.3 離體動(dòng)脈環(huán)舒張描記

2.3.1動(dòng)脈環(huán)活性判定 將動(dòng)脈環(huán)的初始張力調(diào)節(jié)為 1 g，每 20 min更換一次浴槽內(nèi)的 K-H 液。初次平衡 40 min后，檢測(cè)標(biāo)本活性。先使用 PE(10-6mol·L-1)，誘發(fā)動(dòng)脈環(huán)收縮，然后給予 ACh (10-5mol·L-1)，使血管環(huán)舒張，若舒張反應(yīng)大于 70%，則被判定為動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮完整。

2.3.2常氧條件下的動(dòng)脈環(huán)舒張 內(nèi)皮完整的動(dòng)脈環(huán)，沖洗換液后再平衡 40 min，通過(guò)累加給藥觀察血管環(huán)反應(yīng)。先用 PE(10-6mol·L-1)使動(dòng)脈環(huán)再次收縮，其收縮反應(yīng)的最大值被記錄為 Emax，然后依次累加給予 ACh(10-9～10-5mol·L-1)，觀察血管環(huán)舒張效應(yīng)，記錄下各濃度 ACh 誘發(fā)的動(dòng)脈環(huán)舒張值，和 Emax相比較，計(jì)算出舒張反應(yīng)的相對(duì)值(%Emax)，并繪制量-效曲線圖。

另外，對(duì)部分 CIHH 組大鼠內(nèi)皮完整的動(dòng)脈環(huán)，記錄最大收縮值 Emax后，直接沖洗換液后平衡 40 min，分別給予 Indo(10-5mol·L-1)、Gli(10-5mol·L-1)或者 Tempo(10-6mol·L-1)，30 min 后，給予 PE(10-6mol·L-1)使動(dòng)脈環(huán)收縮后，同樣以累加給藥法給予 ACh(10-9～10-5mol·L-1)，觀察常氧條件下 PE 收縮后 ACh誘發(fā)的血管舒張情況受前列環(huán)素、KATP通道和氧自由基的影響。

2.3.3急性低氧條件下的動(dòng)脈環(huán)舒張 常規(guī)處理動(dòng)脈環(huán)后，記錄 PE(10-6mol·L-1)使動(dòng)脈環(huán)收縮的最大值，沖洗換液平衡 40 min，再次給予 PE(10-6mol·L-1)使動(dòng)脈環(huán)收縮，以累加給藥法給予 ACh(10-7～10-5mol·L-1)誘發(fā)舒張。在此次給予 PE 前 20 min 改為持續(xù)通入 95% N2和 5% CO2混合氣導(dǎo)致 K-H 液中氧濃度降低，觀察急性低氧對(duì)動(dòng)脈環(huán)舒張的影響。

同樣，對(duì)部分 CIHH 組大鼠內(nèi)皮完整的動(dòng)脈環(huán)，記錄最大收縮值 Emax后，平衡 40 min，觀察急性低氧條件下 PE 收縮后 ACh 誘發(fā)的血管舒張情況受前列環(huán)素、KATP通道和氧自由基的影響。

3 結(jié)果

3.1 CIHH對(duì)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張的影響常氧條件下，由 ACh(10-7mol·L-1濃度以上)誘發(fā)的胸主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)在 CIHH 處理組大鼠較對(duì)照組大鼠明顯增強(qiáng)，且呈濃度依賴性，隨著 ACh 濃度的增加，增強(qiáng)作用更加明顯。CIHH 處理大鼠的量-效曲線較對(duì)照大鼠明顯向左下移位(P<0.05)。結(jié)果表明，CIHH處理對(duì)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張具有明顯增強(qiáng)效應(yīng)。

Fig 1 Relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-9～10-5 mol·L-1) under normoxia n=6)

Representative tension curve from CIHH (A) and CON (B). Comparison of ACh-induced thoracic aorta relaxation between CIHH and control groups (C). All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol/L).*P<0.05vsCon

3.2 CIHH動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)的維持時(shí)間CIHH 處理后各組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張均明顯大于各自對(duì)照組大鼠，顯示 CIHH 對(duì)動(dòng)脈舒張的增強(qiáng)效應(yīng)在 CIHH 處理后3周依然存在。結(jié)果表明，CIHH 對(duì)發(fā)育大鼠動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)至少可維持3周時(shí)間(P<0.05)。

Fig 2 Duration of ACh-induced (10-9～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation post CIHH groups

ACh-induced (10-9～10-5mol·L-1) thoracic aorta relaxation of one-week (A), two-week (B) and three-week (C) post CIHH groups under normoxia. All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCon

3.3 吲哚美辛，格列本脲和Tempo對(duì)CIHH動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)的影響為探討 CIHH對(duì)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制，我們?cè)诶奂咏o予 ACh 前分別給予 Indo(10-5mol·L-1)、Gli (10-5mol·L-1)和 Tempo(10-6mol·L-1)30 min 預(yù)處理。結(jié)果表明，CIHH 對(duì)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)可被 Indo、Gli 和 Tempo 完全阻斷(P<0.05)。

Fig 3 Effect of Indo, Gli and Tempo pre-treatment on ACh-induced (10-7～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation of CIHH and control groups under normoxia n=6)

All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCIHH

3.4 急性低氧對(duì)CIHH動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)的影響急性低氧條件下，由 ACh 誘發(fā)的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯減弱，其量-效曲線明顯向左下移位(P<0.05)。CIHH 處理組與 Con 組大鼠相比較，CIHH 處理大鼠動(dòng)脈環(huán)舒張減弱的程度明顯小于 Con 組大鼠(P<0.05)，此作用可被 Indo 和 Tempo 所消除(P<0.05)。結(jié)果表明， CIHH 處理減輕急性低氧對(duì)動(dòng)脈舒張功能的抑制，抑制作用與前列環(huán)素和氧自由基有關(guān)。

4 討論

本研究應(yīng)用離體動(dòng)脈環(huán)張力描記方法，首次觀察 CIHH 處理對(duì)發(fā)育大鼠離體主動(dòng)脈環(huán) ACh 誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性舒張的影響及其機(jī)制。結(jié)果顯示，CIHH 可明顯增強(qiáng)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈 ACh 誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性舒張，此效應(yīng)可維持至少 3 周時(shí)間，并可被 Indo、Gli 和 Tempo 所阻斷。結(jié)果提示，CIHH 對(duì)血管內(nèi)皮依賴性舒張?jiān)鰪?qiáng)作用與前列環(huán)素、ATP 敏感鉀通道(KATP)和氧自由基有關(guān)。此外，研究結(jié)果亦顯示，CIHH處理可對(duì)抗急性低氧對(duì)血管舒張的抑制，從而進(jìn)一步證實(shí) CIHH 對(duì)血管功能的保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管內(nèi)表面，在維持血管的收縮舒張之間的平衡等方面具有十分重要的意義。ACh 可通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 NO，通過(guò) NO-cGMP 途徑，導(dǎo)致血管舒張[9]。通常以 ACh 誘發(fā)的血管舒張衡量 NO 所介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。有研究報(bào)道，CIHH 可通過(guò)增加 NO 發(fā)揮心血管保護(hù)作用[10]。本研究結(jié)果顯示，CIHH 對(duì) ACh 誘發(fā)的主動(dòng)脈舒張具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，提示 CIHH的增強(qiáng)血管舒張作用可能通過(guò)增加血管內(nèi)皮 NO 產(chǎn)生所實(shí)現(xiàn)。

Fig 4 Relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-7～10-5 mol·L-1) under acute hypoxia n=6)

Representative tension curve of relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-7～10-5mol·L-1) from CIHH (A) and CON (B) under acute hypoxia. Comparison of ACh-induced thoracic aorta relaxation between acute hypoxia CIHH and acute hypoxia control/normoxia CIHH groups (C). All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05 CIHH under acute hypoxiavsCIHH under normoxia,#P<0.05 CIHH under acute hypoxiavsCon under acute hypoxia

Fig 5 Effect of Indo, Gli and Tempo pre-treatment on ACh-induced (10-7～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation of CIHH and control groups under acute hypoxia n=6)

All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCIHH

前列環(huán)素(prostaglandin，PG)是一種舒血管物質(zhì)，在環(huán)氧合酶等的作用下，會(huì)形成前列環(huán)素(PGI2)。PGI2可通過(guò)刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使血小板中 cAMP增加而抑制血管平滑肌收縮，導(dǎo)致血管舒張[11]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用環(huán)氧合酶的非特異性抑制劑吲哚美辛預(yù)孵育動(dòng)脈環(huán)，可以阻斷 CIHH 處理對(duì) ACh 誘發(fā)的主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)，提示 CIHH 的增強(qiáng)主動(dòng)脈舒張作用可能與血管內(nèi)皮環(huán)氧合酶作用增強(qiáng)、或者 PG 合成與釋放增多有關(guān)。

K+通道可調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮，在調(diào)節(jié)血管張力中發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用 KATP非特異性抑制劑格列苯脲預(yù)孵育動(dòng)脈環(huán)可以阻斷 CIHH 處理對(duì)ACh 誘發(fā)的血管內(nèi)皮依賴性舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)，提示 CIHH 對(duì)主動(dòng)脈舒張的增強(qiáng)效應(yīng)可能與促進(jìn) KATP通道開(kāi)放有關(guān)。我們以往的研究也已證實(shí)，CIHH 增強(qiáng)成年大鼠血管舒張作用可通過(guò)激活阿片受體，從而促進(jìn) KATP通道開(kāi)放所引起[13]。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)大鼠主動(dòng)脈的舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)可被氧自由基清除劑 Tempo 所取消，表明 CIHH 對(duì)主動(dòng)脈舒張?jiān)鰪?qiáng)效應(yīng)與體內(nèi)自由基產(chǎn)生有關(guān)。有研究報(bào)道[14]，自由基參與在缺血預(yù)處理等心臟保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)自由基清除劑清除自由基后可消除心臟保護(hù)作用。聯(lián)系本研究結(jié)果，可以推測(cè) CIHH 作為一種應(yīng)激刺激，可導(dǎo)致體內(nèi)一定程度的氧自由基增加，通過(guò)自由基參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起 NO產(chǎn)生增加，從而增強(qiáng)血管的舒張反應(yīng)，以及對(duì)抗急性低氧對(duì)血管舒張的抑制。

綜上所述，CIHH 處理具有增強(qiáng)發(fā)育大鼠胸主動(dòng)脈舒張并對(duì)抗急性低氧對(duì)動(dòng)脈舒張的抑制，CIHH 對(duì)動(dòng)脈舒張的保護(hù)作用可能與前列腺素生成增多、KATP通道開(kāi)放及氧自由基作用有關(guān)。