黃 瀟，劉 婧，吳建華，付小梅，吳志瑰，裴建國，彭佳鸝，王 芳，楊 超，肖雅靜

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

梔子是茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果實(shí)，性寒、味苦，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效，作為常用清熱藥之一，現(xiàn)代藥理研究已經(jīng)表明其具有良好的抗炎作用［1］。雖然目前研究發(fā)現(xiàn)其中單個(gè)成分具有一定的抗炎作用［2-3］，但卻忽略中藥是多組分、多靶點(diǎn)綜合作用的復(fù)雜整體，其藥效應(yīng)由多個(gè)有效成分共同作用多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生，而梔子中含有眾多成分，主要包括環(huán)烯醚萜類及其苷類、西紅花苷類、有機(jī)酸類［4］，但這些成分與抗炎作用的相關(guān)程度如何，是否存在協(xié)同作用尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本研究建立不同采收期梔子藥材的HPLC 指紋圖譜，采用角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型作為炎癥模型，測(cè)定相關(guān)抗炎指標(biāo)NO、IL-1β、PGE2、TNF-α，最后采用灰色關(guān)聯(lián)分析法將指紋圖譜與炎癥相關(guān)藥效進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以期篩選出梔子抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其后期深度開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器，美國安捷倫公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BS224S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman-Coulter 公司）；PV-200 足趾容積測(cè)定儀（成都盛泰科技有限公司）；SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）。

1.2 藥物和試劑 吲哚美辛腸溶片（批號(hào)A130803，山西云鵬制藥有限公司）；角叉菜膠（批號(hào)22049-5G-F，美國Sigma 公司）。磷酸（分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，西隴化工有限公司）。IL-1β試劑盒（批號(hào)331717）、PEG2試劑盒（批號(hào)339437）、TNF-α 試劑盒（批號(hào)331520）均購于美國R＆D Systems 公司；NO 試劑盒（批號(hào)20151226）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒（批號(hào)20151217）均購于南京建成生物工程研究所。對(duì)照品京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ均為自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)構(gòu)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)按面積歸一化法測(cè)定均大于98%。

梔子由課題組采自江西新干梔子種植基地，以2013年霜降（10 月23 日）為節(jié)點(diǎn)，在此前后定期采集8 批，信息見表1，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范崔生教授鑒定為梔子Gardenia jasminoidesEllis 的果實(shí)，憑證標(biāo)本保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室。除去果梗和雜質(zhì)，蒸至上氣或置沸水中略燙后取出，干燥，放入自封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物 雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物室內(nèi)，溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度（55±2）%。

表1 樣品信息

2 方法和結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 供試品溶液制備 分別稱取S1～S8 號(hào)生梔子6.5 g，加入65 mL 70% 乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，3 000 r／min 離心20 min，0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品制備的對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ適量，加乙醇制成適宜質(zhì)量濃度，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent Eclipse C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，6% A；10～18 min，6%～12% A；18～22 min，12%～16% A；22～28 min，16%～20% A；28～40 min，20% A；40～60 min，20%～36% A；60～65 min，36%～55%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長210 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.4 線性關(guān)系考察 將對(duì)照品溶液按不同比例稀釋，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程為Y＝2.869X＋15.662（R2＝0.999 8），在0.623～6.23 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 指紋圖譜方法學(xué)考察 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，考察精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果均＜3.0%，均符合指紋圖譜建立的技術(shù)要求。

2.1.6 指紋圖譜建立 分別將8 批不同采收期梔子在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得到指紋圖譜，見圖1。共確定31 個(gè)共有峰，其保留時(shí)間、峰面積、最大吸收波長見表2。與對(duì)照品相比，9 號(hào)峰為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷，10 號(hào)峰為梔子苷，26 號(hào)峰為西紅花苷-Ⅰ，28 號(hào)峰為西紅花苷-Ⅱ，30 號(hào)峰為西紅花苷-Ⅲ。

圖1 8 批不同采收期樣品HPLC 指紋圖譜

表2 8 批樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間、峰面積及最大吸收波長

2.2 抗炎作用

2.2.1 浸膏制備 分別稱取S1～S8 號(hào)生梔子65 g，加入650 mL 70%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇至無醇味后進(jìn)行冷凍干燥，得到梔子干浸膏，其得膏率約為15%。臨用前加5%CMC-Na 制成混懸液進(jìn)行使用，剩余混懸液在4 ℃冰箱保存。

2.2.2 梔子提取物對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響 選用雄性SD 大鼠80 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行分組。隨機(jī)分為 10 組，分別為 5% CMC-Na 組、吲哚美辛組（17.5 mg／kg）、生梔子S1～S8 組灌胃給藥（按生藥給藥劑量折算為2.1 g／kg），每組8 只，連續(xù)給藥4 d。在末次給藥后1 h，各組大鼠的右后足跖皮下注射0.1 mL 1%角叉菜膠溶液致炎，在致炎后3 h 測(cè)定每只大鼠右后足趾致炎后的體積，計(jì)算致炎前后體積差以確定抗炎效果，并以足腫脹度作為藥效指標(biāo)。結(jié)果見表3。與模型組比較，各給藥組大鼠足腫脹度均降低（P＜0.01），各給藥組之間比較存在差異（P＜0.01），表明這8 批梔子均具有較好的抗炎作用。

2.2.3 梔子提取物 對(duì)炎癥組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2的影響 選擇確定有抗炎效果的給藥組，脫頸處死大鼠，并剪下炎癥右后足，稱定質(zhì)量，以預(yù)冷的0.9% NaCl 溶液為勻漿介質(zhì)，制備成10%組織勻漿，4 ℃下3 000 r／min 離心15 min，勻漿留上清，測(cè)定組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)果見表4。與模型組比較，各給藥大鼠組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2均降低（P＜0.01），表明這8 批樣品均具有降低炎癥因子水平的能力。

表3 8 批樣品對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（±s）

表3 8 批樣品對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

表4 8 批樣品對(duì)炎癥組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的影響（±s）

表4 8 批樣品對(duì)炎癥組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的影響（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

2.3 梔子提取物指紋圖譜與抗炎因子的灰色關(guān)聯(lián)分析［5］以8 批不同采收期梔子足腫脹度以及炎癥因子作為參考序列，以梔子HPLC 圖譜共有峰峰面積作為比較序列，進(jìn)行灰度關(guān)聯(lián)分析。

2.3.1 原始數(shù)據(jù)無量化處理 由于數(shù)據(jù)中物理意義不同，所以數(shù)據(jù)的量綱也不一定相同，不便于比較，或在比較時(shí)難以得到正確的結(jié)論。因此在進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析時(shí)，需要將數(shù)據(jù)統(tǒng)一進(jìn)行無量綱化處理。本研究采用的無量綱化方法是初值化法。

2.3.2 計(jì)算參考數(shù)列與比較數(shù)列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù) 分別計(jì)算每個(gè)比較序列和參考序列所對(duì)應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)，其公式如下。

式中，x0（k）和xi（k）分別為梔子各批次提取物抗炎藥效指標(biāo)及各批次提取物特征峰面積，均做無量綱化處理；k為峰號(hào)；ρ為分辨系數(shù)，在0～1 內(nèi)取值，若ρ越小，關(guān)聯(lián)系數(shù)間差異越大，區(qū)分能力越強(qiáng)，一般情況下ρ取0.5。

2.3.3 計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度 關(guān)聯(lián)系數(shù)的算術(shù)平均數(shù)為關(guān)聯(lián)度，其計(jì)算公式如下。

式中，n為子序列個(gè)數(shù)。關(guān)聯(lián)度計(jì)算結(jié)果結(jié)果見表5，可知8 批梔子共有峰與足腫脹度作用的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，對(duì)抗炎作用藥效貢獻(xiàn)度較大（關(guān)聯(lián)度＞0.65）的共有峰（峰號(hào)）主要有10＞2＞9＞4＞3＞26＞1＞31＞23＞28＞12＞29＞21，由此說明梔子提取物的抗炎作用是化學(xué)成分群共同作用的結(jié)果，其中對(duì)抗炎作用貢獻(xiàn)最大的前5 個(gè)峰分別為10、2、9、4、3 號(hào)峰，與“2.1.6”項(xiàng)下結(jié)果比較可以得知，10 號(hào)峰為梔子苷、9 號(hào)峰為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。其中，對(duì)NO 貢獻(xiàn)較大的共有峰（峰號(hào)）主要有10＞4＞11＞3＞25＞2＞9＞23＞29＞22＞24＞15＞16＞30＞5，對(duì)IL-1β 貢獻(xiàn)較大的共有峰（峰號(hào)）主要有10＞20＞13＞18＞25＞4＞9＞3＞2＞27＞15＞5，對(duì)TNF-α 貢獻(xiàn)較大的共有峰（峰號(hào)）主要有1＞10＞2＞3＞9＞16＞15＞11＞7＞18＞4＞21＞12＞14＞17；對(duì)PGE2貢獻(xiàn)較大的共有峰（峰號(hào)）主要有3＞10＞5＞13＞2＞9＞14＞23＞4＞29＞17＞8＞31＞11＞24＞27＞28＞12。綜合比較可以發(fā)現(xiàn)，10、2、9、4、3 號(hào)峰對(duì)各個(gè)炎癥因子均起到較大的貢獻(xiàn)度。

表5 8 批樣品峰面積與足腫脹度及炎癥組織中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的關(guān)聯(lián)度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立在梔子指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對(duì)于梔子中所含的主要成分，在利用HPLC 法測(cè)定圖譜時(shí)所選擇的波長并不相同，通常環(huán)烯醚萜類及其苷類為238 nm，有機(jī)酸類為320 nm，西紅花苷類為440 nm，因此為得到同一波長下梔子各成分的指紋圖譜，選用210 nm 作為檢測(cè)波長。

為了能夠?qū)灿蟹宓慕Y(jié)構(gòu)類型進(jìn)行推測(cè)，故采用HPLC 對(duì)31 個(gè)共有峰進(jìn)行全波長掃描。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6-7］以及前期研究可以得知，環(huán)烯醚萜類成分的最大吸收波長為238 nm 附近，故推測(cè)峰1、2、3、9、10、11、13、16、17、18、19、20、21、22 為環(huán)烯醚萜類成分；西紅花苷類成分最大吸收波長為440 nm 附近，故推測(cè)峰26、28、29、30、31 為西紅花苷類成分。

梔子作為常用中藥之一，之前研究已經(jīng)表明其具有較好的抗炎作用，然而對(duì)其具體的抗炎物質(zhì)并沒有探索，而中藥作為一個(gè)極其復(fù)雜的化合物體系，其發(fā)揮治療作用的原因很有可能是由幾種成分甚至幾類成分互相作用的結(jié)果，通過 譜效關(guān)系研究，對(duì)揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)極為重要［8］。故以角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型作為炎癥模型，選用足腫脹度作為抗炎的藥效指標(biāo)，并在此模型上采用灰色關(guān)聯(lián)分析方法將梔子共有峰和抗炎藥效相互關(guān)聯(lián)，從而篩選出梔子抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)抗炎作用貢獻(xiàn)最大的前5 個(gè)峰為10、4、2、9、3 號(hào)峰，其中10、2、9、3的最大吸收波長均為238 nm 左右，故此推測(cè)這4 種成分為環(huán)烯醚萜類。同時(shí)與對(duì)照品的液相譜圖比較可以得知，10號(hào)峰為梔子苷，9 號(hào)峰為京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷。這也與之前文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)烯醚萜類具有較好抗炎作用相符［9-11］。梔子苷為2015 年版《中國藥典》規(guī)定的藥材評(píng)價(jià)指標(biāo)成分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，S1～S8 批梔子的梔子苷含有量分別為36.13、34.55、31.61、30.89、35.21、29.79、26.86、35.99 mg／g。

中藥是作為一個(gè)多組分、多靶點(diǎn)綜合作用的復(fù)雜整體，其藥效作用應(yīng)由多種有效成分共同作用多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生的效果，而炎癥的發(fā)生正是由于機(jī)體受到各種損傷因子刺激后，血管系統(tǒng)的活體組織產(chǎn)生的防御反應(yīng)，整個(gè)過程是1 個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其抗炎作用往往受到多條通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。故本研究同時(shí)選用調(diào)節(jié)不同炎癥通路的相關(guān)因子作為指標(biāo)進(jìn)行研究，花生四烯酸代謝產(chǎn)物之一PGE2，致炎因子IL-1β、TNF-α 以及由氧分子以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶催化生成的小分子的NO［12-13］。通過測(cè)定大鼠炎癥組織中NO、PGE2、IL-1β、TNF-α 水平，發(fā)現(xiàn)梔子提取物能通過顯著抑制NO 的產(chǎn)生，減少PGE2的生成，抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α 的合成與釋放來發(fā)揮其抗炎作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用灰色關(guān)聯(lián)分析將梔子共有峰和抗炎因子相互關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明10、4、2、9、3 號(hào)峰均對(duì)這些因子起著較大的貢獻(xiàn)，進(jìn)一步說明梔子中的這些成分均有一定抗炎作用，只不過是通過不同炎癥通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。由此可知，這些成分起著相互協(xié)同的作用，正符合中藥“多成分，多靶點(diǎn)”綜合作用的特點(diǎn)。

下一步的工作重點(diǎn)是對(duì)這些共有峰進(jìn)行定性分析、藥效評(píng)價(jià)等研究，以期進(jìn)一步確定梔子抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)新型抗炎中成藥打下基礎(chǔ)。