邢 月，盧 鵬，閆宏麗，梁春霞，謝佳蓉，劉志東

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 301617）

三七是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，具有散瘀止血、消腫定痛的作用［1］，其主要成分三七總皂苷在擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)障礙、抑制血小板凝集、緩解視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)等方面療效顯著［2-4］。目前，以該成分為單一主藥上市的制劑大多為注射給藥制劑與口服制劑，可治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥、角膜病、內(nèi)眼病、眼前方出血、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等眼部疾病［5-6］。

微乳作為一種新型藥物制劑，是由水相、油相、表面活性劑、助表面活性劑，按一定比例自發(fā)形成的一種粒徑≤200 nm 的分散體系［7-8］，具有黏度低、熱力學(xué)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單、生物相容性好、注射時(shí)可減少患者疼痛感等優(yōu)點(diǎn)［9-10］。

課題組前期制備了三七總皂苷微乳，并進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究［11］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上通過(guò)家兔耳緣靜脈注射給藥，研究其藥動(dòng)學(xué)，對(duì)相關(guān)制劑開發(fā)與改進(jìn)具有一定參考意義。

1 材料

1.1 儀器 高壓均質(zhì)機(jī)（ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司）；FA25 高剪切分散乳化機(jī)（德國(guó)Fluko 公司）；Nano ZS 激光粒徑測(cè)定儀（英國(guó)Malvern 公司）；KQ-400DE 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司，配置Agilent 1290 高效液相色譜儀、Agilent 6460 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、MassHunter 工作站）；FA124 電子天平（萬(wàn)分之一，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；AX205 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；SZCL-4B 智能磁力加熱攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CMA402 微透析泵、CMA30線型微透析探針（瑞士CMA 公司）。

1.2 試劑與藥物 三七總皂苷原料藥（云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司，批號(hào)021108，人參皂苷Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)44.470%，三七皂苷R1質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.056%）；大豆磷脂（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)SY-SI-170103）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944CS，法國(guó)佳法賽公司）。人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201832，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.4%）、三七皂苷 R1（批號(hào) 110745-201820，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。注射用血栓通（凍干）（廣西梧州制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)17010216，人參皂苷Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)48.117%，三七皂苷R1質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.370%）。去離子水（由Milli-Q 純水機(jī)制備）；其他試劑均為色譜純。

1.3 動(dòng)物 新西蘭白兔，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（津）2014-0001，動(dòng)物倫理號(hào)TCM-LAEC2018031。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七總皂苷微乳制備及初步評(píng)價(jià) 微乳制備采用課題組前期報(bào)道的方法［11］，處方為58%Labrafil M 1944CS、25%磷脂／乙醇（Km＝1）、17%三七總皂苷溶液（400 mg／mL）。按處方量稱定油相、乳化劑、三七總皂苷溶液于燒杯中，50 ℃水浴攪拌均勻，分散3 min 后80 MPa 下均質(zhì)5 次，即得。激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖1，可知微乳（人參皂苷Rg1、三七皂苷R1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.983%、0.606%）平均粒徑為（170.23±0.91）nm，PDI 為0.29±0.01。

圖1 微乳粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of microemulsions

2.2 含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，18% B；7～13 min，18%～40%B；13～14 min，40%～18%B；14～15 min，18% B）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源，正離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；人參皂苷Rg1m／z823.48～643.3，三七皂苷R1m／z955.52～775.3；碰撞電壓，人參皂苷Rg1280 V，三七皂苷R1300 V；碰撞能量，人參皂苷Rg142 eV，三七皂苷R150 eV；電噴霧電壓4 kV；霧化氣體N2；噴霧氣40 psi（1 psi＝6.895 kPa）；干燥氣溫度350 ℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取空白、對(duì)照品、供試品微透析液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知對(duì)照品、供試品微透析液中人參皂苷Rg1、三七皂苷R1保留時(shí)間一致，空白微透析液無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 方法專屬性色譜圖Fig.2 Chromatograms of method specificity

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)照品適量于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋成每1 mL 分別含兩者1.022、0.98 mg 的溶液，精密量取適量，0.9% NaCl 溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為Y＝33.562X－5.304（R2＝0.999 4）、Y＝46.037X－7.760（R2＝0.999 6），分別在0.511～511、0.490 5～490.5 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，平行6 份，于日內(nèi)、日間在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，可知該方法精密度良好。

表1 各成分精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of precision tests for various constituents（n＝6）

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，平行6 份，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察人參皂苷Rg1、三七皂苷R1分別在室溫下放置15 h、4 ℃下放置12 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表2，可知溶液在相應(yīng)條件下穩(wěn)定性良好。

2.4 探針體內(nèi)回收率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前，向家兔右眼周圍皮下注射鹽酸利多卡因（0.75 mL／kg）充分麻醉［12］，在兔眼對(duì)外部刺激無(wú)反應(yīng)時(shí)撐開眼瞼，沿角膜結(jié)膜緣前將10 mL 針頭傾斜刺入眼前房室內(nèi)，沿針頭一端將微透析探針的透析窗嵌入眼內(nèi)，抽出針頭，調(diào)整透析窗，使其完全置于房水中，針兩端分別在鼻翼側(cè)和外眼角固定［13］。然后，將微透析探針植入家兔眼內(nèi)，使用微透析泵，以5、25、100、500、1 000 ng／mL NaCl 溶液為灌注液，體積流量1.5 μL／min，每種質(zhì)量濃度平衡30 min，每30 min 收集1 份樣品，平行3 次，測(cè)定探針體內(nèi)回收率，回收率＝［（Cd-Cp）／Cp］×100%，其中Cd為透析液中含藥量，Cp為灌注液中含藥量［14］。結(jié)果，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1探針體內(nèi)回收率分別為（28.07±1.42）%、（22.74±0.71）%。

表2 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of stability tests for various constituents（n＝6）

2.5 藥動(dòng)學(xué)研究 12 只家兔隨機(jī)分成2 組，每組6只，分別給予微乳和注射用血栓通（凍干）溶液（精密稱取血栓通凍干粉355.4 mg 于50 mL量瓶中，0.9% NaCl 溶液稀釋至刻度，配制成7.108 mg／mL溶液）。按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，以1.5 μL／min體積流量向探針內(nèi)灌注生理鹽水，平衡1 h 后耳緣靜脈注射6.74 mg／kg 微乳和注射用血栓通（凍干）溶液（以人參皂苷Rg1計(jì)，0.34 mL 前者相當(dāng)于1.97 mL 后者），開始收集透析液，0～6 h 每30 min收集1 份，6～8 h 每1 h 收集1 份。然后，通過(guò)LC-MS／MS 法測(cè)定微滲析液中人參皂苷Rg1、三七皂苷R1含有量，WinNonlin6.0 版藥動(dòng)學(xué)軟件、SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。由此可知，微乳組人參皂苷Rg1、三七皂苷R1Cmax、AUC0～8h、Vz／F、CL／F高于注射用血栓通（凍干）組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for samples

表3 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

表3 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

注：與注射用血栓通（凍干）組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論與結(jié)論

三七總皂苷為水溶性成分，分子結(jié)構(gòu)大，不易透過(guò)血眼屏障，故可利用其微乳給藥系統(tǒng)提高其滲透性，改善其在眼部的生物利用度。本實(shí)驗(yàn)基于微透析技術(shù)，通過(guò)兔耳緣靜脈注射三七總皂苷微乳及注射用血栓通（凍干）進(jìn)行眼部藥動(dòng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)相較于注射用血栓通（凍干）組，三七總皂苷微乳組人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的Cmax、AUC0～8h顯著升高，Vz／F、CL／F顯著降低，生物利用度分別為（290.62±63.64）%、（587.78±148.07）%，表明三七總皂苷微乳在家兔眼內(nèi)消除速度慢，可顯著增加藥物在眼部的濃度，從而更好地透過(guò)血眼屏障，提高生物利用度。其原因一方面是由于三七總皂苷微乳中的油相可增強(qiáng)其親脂性，進(jìn)而提高藥物血眼屏障滲透性［15］；另一方面，微乳粒徑較小，可增大藥物與眼部的接觸面積，更易透過(guò)血眼屏障，從而促進(jìn)藥物吸收［16］。

本實(shí)驗(yàn)采用的LC-MS／MS 法準(zhǔn)確度高，專屬性好。另外，三七總皂苷微乳組人參皂苷Rg1、三七皂苷R1在家兔眼部中的藥物濃度到達(dá)Cmax后迅速下降，其原因有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兔耳緣靜脈注射三七總皂苷微乳，利用其高滲透、小粒徑特性提高了三七總皂苷在眼部的生物利用度，為其治療眼部疾病及相關(guān)制劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。