王鳳嬌，鐘凌云，鐘國躍，張壽文

（江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004）

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq 的干燥根，夏秋二季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后除去外皮干燥，或洗凈直接干燥［1］，其性甘、微苦、微寒，歸肺、胃經，具有清肺養(yǎng)陰、潤肺止咳、益胃生津等功效［2］，主要化學成分有揮發(fā)油、糖苷、香豆素等，還含有淀粉、三萜酸、豆甾醇、磷脂、氨基酸等［3］。其中，香豆素類具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用［4］，主要包括補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素等［5］。

北沙參的炮制始于近代，《中藥炮炙經驗集成》中收載有切制、炒黃、蜜炙、米炒等方法，目前臨床以切段生用為主，但各地炮制規(guī)范中仍有蜜炙存在；2015 年版《中國藥典》未收錄北沙參飲片含有量的測定方法。本實驗同時測定其中補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素5 種香豆素的含有量，并以其為評價指標對炮制工藝進行優(yōu)化，以期為該藥材規(guī)范化生產提供科學依據，也為新版《中國藥典》的修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器 101-1A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海滬粵明科技儀器有限公司）；DFY-400 型搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；C21-RK2106 型美的多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；鐵鍋（浙江蘇泊爾股份有限公司）；Raynger ST20 型紅外測溫儀（美國Raytek 公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；AE240 型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；UItiMate 3000型高效液相色譜儀，配置PDA-3000 型二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 工作站（美國Dionex 公司）。

1.2 試劑與藥物 補骨脂素（批號17061203）、花椒毒素（批號17072005）、佛手柑內酯（批號17041303）、歐前胡素（批號wkq16121908）、異歐前胡素（批號wkq17050304）對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，質量分數(shù)≥98%）。北沙參由內蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司提供，經江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室葛菲老師鑒定為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq的干燥根。汪氏蜂蜜（江西汪氏蜜蜂園有限公司）。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 生品制備 取長短粗細相似的藥材9 份，按正交試驗方案悶潤一段時間、切制一定長度后放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，設置不同溫度進行干燥，取出，放涼，即得。

2.2 蜜炙品制備 將蜂蜜置于鍋內，加熱至徐徐沸騰后改用文火，保持微沸，除去泡沫及上浮蠟質，羅篩或紗布濾去死蜂、雜質，再傾入鍋內，加熱至116～118 ℃，當滿鍋魚眼泡、用手捻之有黏性、兩指間無長白絲出現(xiàn)時迅速出鍋，作為煉蜜［1］。取生品各100 g，按正交試驗方案加入含一定比例開水的煉蜜，拌勻，悶潤，置于炒藥鍋中，按設定的不同溫度（紅外溫度儀測定鍋溫）炒炙一段時間，取出，晾涼，篩去碎屑，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 色譜條件［6-8］Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水，梯度洗脫（0～5 min，40%～45% 乙腈；5～20 min，45%～80% 乙腈；20～30 min，80%～40% 乙腈）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長310 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various consituents

2.3.2 對照品溶液制備［9-10］精密稱取補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素對照品適量，甲醇稀釋定容，即得（各成分質量濃度分別為0.031、0.075、0.065、0.046、0.054 mg／mL）。

2.3.3 供試品溶液制備［11-13］取生品、蜜炙品粉末（過40 目）各約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1、2、4、5、8 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程分別為補骨脂素Y＝0.302 3X－0.198 1（r＝0.999 2），線性范圍0.496～7.44 μg／mL；花椒毒素Y＝1.183 2X－0.995 9（r＝0.999 4），線性范圍1.2～18 μg／mL；佛手柑內酯Y＝1.686 8X－1.043 3（r＝0.999 3），線性范圍 1.04～15.6 μg／mL；歐前胡素Y＝0.707X－0.507 7（r＝0.999 2），線性范圍0.736～11.04 μg／mL；異歐前胡素Y＝0.973 1X－0.693 5（r＝0.999 1），線性范圍0.864～12.96 μg／mL。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.76%、0.23%、0.12%、0.39%、0.42%，表 明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液10 μL，于0、2、4、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.57%、0.34%、0.25%、0.31%、0.52%，表 明溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 精密稱取同一生品粉末6 份，按“2.3.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量RSD 分別為0.68%、0.53%、0.34%、0.29%、0.46%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取含有量已知的生品、蜜炙品粉末各約1 g，各精密稱定6 份，精密加入等量對照品溶液，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，生品中補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素平均加樣回收率（RSD）分別為99.6%（0.63%）、99.8%（0.54%）、100.3%（0.32%）、98.8%（0.28%）、97.8%（0.46%），蜜炙品中分別為99.2%（0.64%）、99.8%（0.54%）、101.2%（0.33%）、98.7%（0.27%）、97.9%（0.48%）。

2.4 炮制工藝優(yōu)化 以潤制時間（A）、切段長度（B）、干燥溫度（C）為影響因素，正交試驗優(yōu)化生品制備工藝，因素水平見表1；以煉蜜與水比例（A）、悶潤時間（B）、炒炙溫度（C）、炒炙時間（D）為影響因素，正交試驗優(yōu)化蜜炙品制備工藝，因素水平見表2。

表1 生品因素水平Tab.1 Factors and levels for raw products

表2 蜜炙品因素水平Tab.2 Factors and levels for honey-fried products

選擇飲片性狀及補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量作為生品評價指標。參照2015 年版《中國藥典》北沙參性狀項下規(guī)定，將飲片性狀評分標準確定為表面黃白色80～100 分，表面淡黃白色50～70 分，總分100分；精密吸取對照品溶液及生品1～9 號供試品溶液各10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算各成分含有量。再計算綜合評分［14］，滿分100 分，公式為：綜合評分＝飲片性狀評分×0.5＋補骨脂素含有量×0.1＋花椒毒素含有量×0.1＋佛手柑內酯含有量×0.1＋歐前胡素含有量×0.1＋異歐前胡素含有量×0.1，結果見表3，方差分析見表4。由此可知，因素B（切段長度）對試驗結果有顯著影響（P＜0.05）；最優(yōu)工藝為A2B1C3，即潤制24 h后切制5 mm 短段，60 ℃下干燥，烘干，取出，放涼，篩去碎屑。

選擇飲片性狀及補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素含有量作為蜜炙品評價指標。參照2015 年版《中國藥典》北沙參性狀項下規(guī)定，將飲片性狀評分標準［15］確定為深黃色有光澤40 分，黃色略有光澤30 分，黃白色無光澤20 分；不黏手30 分，略黏手20 分，黏手10 分；蜜香味濃30 分，有蜜香味20 分，蜜香味淡10 分，滿分100 分，再同法計算各成分含有量和綜合評分，結果見表5，方差分析見表6。由此可知，因素A（煉蜜與水比例）、C（溫度）對試驗結果有顯著影響（P＜0.05）；最優(yōu)工藝為A2B2C3D2，即煉蜜與水按1∶1 比例混合后加入干凈飲片，拌勻，悶潤40 min，150 ℃（鍋底溫度）下炒炙30 min，取出，放涼，篩去碎屑，每100 kg 飲片加煉蜜25 kg。

表3 生品試驗設計與結果Tab.3 Design and results of tests for raw products

表4 生品方差分析Tab.4 Analysis of variance for raw products

表5 蜜炙品試驗設計與結果Tab.5 Design and results of tests for honey-fried products

表6 蜜炙品方差分析Tab.6 Analysis of variance for honey-fried products

2.5 驗證試驗 取3 份粗細大小均勻的藥材，按“2.4”項下優(yōu)化工藝制備生品，發(fā)現(xiàn)其表面呈黃白色，質堅而脆，各成分含有量穩(wěn)定，RSD（n＝3）＜1%；取3 份生品，每份100 g，按“2.4”項下優(yōu)化工藝制備蜜炙品，發(fā)現(xiàn)其表面呈深黃色，不粘手，具有蜜香氣，各成分含有量穩(wěn)定，RSD（n＝3）＜1%。

3 討論

本實驗所選取的外觀性狀指標是較直觀的色澤、氣味等，可通過眼觀、鼻聞、手觸等傳統(tǒng)飲片質量鑒別方法進行考察，可避免單純以化學指標定質量的不足，從而可更全面地對北沙參質量進行判斷。另外，北沙參中補骨脂素、花椒毒素、歐前胡素、異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌作用，而佛手柑內酯具有抗腫瘤作用，同時這5 種香豆素又為該藥材主要化學成分，故以其為評價指標考察炮制工藝。

正交試驗考察指標時采用了綜合評分，將外觀性狀和內在質量相結合，可較客觀地反映各因素之間的關系，以及因素水平對北沙參生品、蜜炙品質量的影響。本實驗通過該方法篩選出北沙參最佳炮制工藝，在悶潤時間、切制長度、干燥溫度方面確定了生品具體參數(shù)，而在煉蜜與水比例、悶潤時間、炒炙溫度、炒炙時間方面確定了蜜炙品的具體參數(shù)，可為規(guī)范藥材炮制、指導企業(yè)生產、保證飲片質量提供參考依據。