石效榮，劉義升*，邢樹(shù)禮，盧立明，李艷江，劉 煥，王 越，賈善學(xué)

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濱州 256603； 2.濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濱州 256600）

天麻醒腦膠囊是由天麻、熟地黃、肉蓯蓉、石菖蒲、地龍、遠(yuǎn)志6 味藥材加工而成的中藥制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛的功效，臨床上主要用于記憶力減退、反應(yīng)遲鈍、失眠、頭痛、頭暈、耳鳴、腰酸等病癥的治療［1］，可明顯增加大鼠腦血液流量，改善小鼠腦血液循環(huán)，具有抗腦缺血缺氧作用［2］，通過(guò)降低腦組織乙酰膽堿水平、減少自由基產(chǎn)生來(lái)改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙［3］，通過(guò)多種途徑改善記憶損傷模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能［4］，對(duì)后循環(huán)缺血性眩暈［5］、頸性眩暈［6］、慢性緊張型頭痛［7］、椎基底動(dòng)脈供血不足眩暈［8］、改善血管性認(rèn)知功能障礙［9］等疾病臨床效果顯著。

2015 年版《中國(guó)藥典》一部［1］僅以天麻素含有量為指標(biāo)，對(duì)天麻醒腦膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制，前期文獻(xiàn)報(bào)道也僅涉及到該成分［10-11］，而該制劑成分復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，單一成分難以全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定天麻醒腦膠囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含有量，以期全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；BP-211D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。天麻素（批號(hào)110807-201809，含純度 96.7%）、β-細(xì)辛醚（批號(hào)112018-201802，含純度99.3%）、松果菊苷（批號(hào)111670-201706，含純度89.7%）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201713，含純度92.5%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；巴利森苷E（批號(hào)PRF16011523，含純度97.1%）、巴利森苷B（批號(hào)14122013，含純度98.5%）、巴利森苷C（批號(hào)PRF7101341，含純度98.4%）、巴利森苷A（批號(hào)14122302，含純度98.4%）、α-細(xì)辛醚對(duì)照品（批號(hào)PRF8051843，含純度99.2%）均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。天麻醒腦膠囊（0.4 g／粒，批號(hào)20181104、20181116、20181214）源自云南永孜堂制藥有限公司。乙腈、甲醇為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相［乙腈-甲醇（1∶1）］（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～13.0 min，11.0% A；13.0～32.0 min，11.0%～28.0% A；32.0～41.0 min，28.0%～ 45.0% A；41.0～56.0 min，45.0%～72.0% A；56.0～65.0 min，72.0%～11.0% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm［1，10-12］（0～32.0 min，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A）、330 nm［13-15］（32.0～41.0 min，松果菊苷、毛蕊花糖苷）、257 nm［16］（41.0～65.0 min，β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，50% 甲醇分別制成 0.426、0.538、0.132、0.298、0.914、0.576、0.212、1.478、0.652 mg／mL貯備液，各精密量取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，50%甲醇制備，即得（含21.3 μg／mL 天麻素、26.9 μg／mL 巴利森苷E、6.6 μg／mL 巴利森苷B、14.9 μg／mL 巴利森苷C、45.7 μg／mL 巴利森苷A、28.8 μg／mL 松果菊苷、10.6 μg／mL 毛蕊花糖苷、73.9 μg／mLβ-細(xì)辛醚、32.6 μg／mLα-細(xì)辛醚）。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取45 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按2015 年版《中國(guó)藥典》一部中膠囊處方工藝，分別制備缺天麻、肉蓯蓉和熟地黃、石菖蒲的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分與相鄰色譜峰均能達(dá)到有效分離（分離度均大于1.5），理論塔板數(shù)均不低于4 500，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液各2.0 mL，置于20 mL 量瓶中，50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，取適量用50%甲醇依次稀釋2、5、10、15、20 倍，制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚峰面積RSD 分別為0.95%、1.03%、1.22%、0.87%、0.71%、1.16%、1.34%、0.59%、0.61%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚含有量RSD 分別為1.15%、1.47%、0.82%、1.26%、1.19、1.62%、1.35%、0.94%、1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚峰面積RSD 分別為0.71%、0.66%、1.18%、1.31%、0.94%、1.13%、1.29%、0.63%、0.74%，表明溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同1 批膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱取9 份，每3份為1 組，每份約0.1 g，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國(guó)藥典》四部要求，使對(duì)照品加入量相當(dāng)于樣品量的50%、100%、150%，精密加入對(duì)照品溶 液（含 0.254 mg／mL 天麻素、0.322 mg／mL巴利森苷E、0.094 mg／mL 巴利森苷B、0.206 mg／mL 巴利森苷C、0.574 mg／mL 巴利森苷A、0.346 mg／mL 松果菊苷、0.156 mg／mL 毛蕊花糖苷、0.942 mg／mLβ-細(xì)辛醚、0.418 mg／mL α-細(xì)辛 醚）0.5、1.0、1.5 mL，各 3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚平均加樣回收率分別為99.14%、98.86%、96.97%、99.40%、98.37%、97.89%、97.46%、100.00%、96.88%，RSD 分別為0.94%、1.03%、1.29%、0.88%、1.52%、1.27%、1.30%、0.81%、1.16%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3 批膠囊適量，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱取約0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分確定 天麻醒腦膠囊中天麻功效息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)，為君藥；地龍功效清熱定驚、通絡(luò)平喘，熟地黃、肉蓯蓉功效滋陰補(bǔ)腎、填精補(bǔ)髓，石菖蒲、遠(yuǎn)志功效化痰開(kāi)竅、醒神益智，諸藥合奏，共達(dá)滋補(bǔ)肝腎、平肝息風(fēng)、通絡(luò)定眩之效。研究顯示，天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 等天麻素類成分為天麻主要活性成分，松果菊苷、毛蕊花糖苷等苯乙醇苷類為肉蓯蓉主要活性成分，毛蕊花糖苷為熟地黃中苯乙醇苷類代表性成分，β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚等揮發(fā)油為石菖蒲主要活性成分，故本實(shí)驗(yàn)選取上述9 種成分作為指標(biāo)成分。

3.2 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷 酸［1，11-12］、甲 醇-0.1% 甲 酸［13-14，16-17］、乙腈-0.1% 甲酸［18］、乙腈-0.1% 冰醋酸［15］，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸為流動(dòng)相時(shí)，基線不平穩(wěn)，巴利森苷B 峰拖尾嚴(yán)重，巴利森苷B、巴利森苷C 分離度不符合要求；以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí)，基線不平穩(wěn)；以甲醇-0.1%甲酸為流動(dòng)相時(shí)，天麻素達(dá)不到基線分離，故將乙腈和甲醇按1∶1 比例混合后，再與0.1%甲酸一起梯度洗脫，同時(shí)對(duì)兩者比例不斷摸索，最終確定為“2.1”項(xiàng)下條件。

3.3 供試品溶液提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（甲醇［10，15-16］、50%甲醇［13-14］、乙醇、稀乙醇［12］）、提取方式（超聲提?。?0-17］、加熱回流提?。?duì)天麻醒腦膠囊中各成分綜合提取率、色譜峰峰形、檢測(cè)時(shí)間的影響，同時(shí)比較了提取時(shí)間30、45、60 min。最終確定，供試品溶液提取方法為50%甲醇加熱回流提取45 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定天麻醒腦膠囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含有量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可為該制劑質(zhì)量控制和綜合評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。