劉彬彬 龔道方 陳振華 郭婧瑋 余艷艷 劉豐平 歐陽(yáng)輝 譚云洪

2018年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告提出，中國(guó)結(jié)核病診斷方面的問題之一為中國(guó)肺結(jié)核細(xì)菌學(xué)檢出率低，僅為31%，遠(yuǎn)低于世界平均水平(57%)[1]。目前，市場(chǎng)上不斷涌現(xiàn)出各種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測(cè)方法并廣泛應(yīng)用于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷領(lǐng)域，從其中選擇一種適合不同實(shí)驗(yàn)室條件、準(zhǔn)確且性價(jià)比高的檢測(cè)方法尤為重要。目前，湖南省每年肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽(yáng)性檢出率較低，且實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的普及程度不夠，因此，本課題組采用前瞻性的方法，通過對(duì)結(jié)核病患者同一份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行液基夾層杯涂片(采用集菌法；簡(jiǎn)稱“涂片法”)、L-J固體培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱“L-J培養(yǎng)法”)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)(采用恒溫?cái)U(kuò)增法；簡(jiǎn)稱“恒溫?cái)U(kuò)增法”)，比較3種方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢出率的差異，為湖南省各家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的選擇提供參考依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

采用隨機(jī)數(shù)字表的方法，從湖南省120家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院中抽取3家作為研究現(xiàn)場(chǎng)，分別為瀏陽(yáng)市人民醫(yī)院、醴陵市湘東醫(yī)院、桃江縣人民醫(yī)院。以3家醫(yī)院2018年11月1日至12月31日就診的肺結(jié)核可疑癥狀者(咳嗽、咳痰2周及以上或痰中帶血)為研究對(duì)象，根據(jù)臨床癥狀、胸部X線攝片及實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目結(jié)果，并依據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[2]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行診斷。3家醫(yī)院入選患者共636例，剔除未留取標(biāo)本的患者，最終628例患者納入本研究。其中，男463例(73.7%)，女165例(26.3%)；年齡6～94歲，平均年齡(59.4±15.2)歲。

二、研究方法與內(nèi)容

采用配對(duì)設(shè)計(jì)的方法，即一份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行檢測(cè)，再進(jìn)行比較，具體方法如下。

1.標(biāo)本留取及L-J固體培養(yǎng)：每例患者用痰液收集瓶收集3～5 ml痰標(biāo)本(可多次留)，首先采用4%的氫氧化鈉溶液對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行充分液化，靜置15 min后用無(wú)菌滴管取0.1 ml接種到酸性羅氏培養(yǎng)基上(接種2管)，同時(shí)將剩余的液化標(biāo)本送至分子生物檢測(cè)室。每周觀察1次培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)后，將陽(yáng)性菌株送至湖南省參比實(shí)驗(yàn)室，由專門的工作人員挑取菌落完成涂片，菌落經(jīng)抗酸染色鏡檢呈陽(yáng)性者報(bào)告培養(yǎng)陽(yáng)性；2個(gè)月未見菌落生長(zhǎng)報(bào)告培養(yǎng)陰性。同一例患者的2管接種標(biāo)本中，任何一管發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌生長(zhǎng)即判定為L(zhǎng)-J培養(yǎng)陽(yáng)性。

2. 恒溫?cái)U(kuò)增法：吸取培養(yǎng)后剩余的充分液化的痰標(biāo)本1 ml加入帶旋蓋的離心管中(同時(shí)將剩余的液化痰標(biāo)本送至液基涂片室)，以離心半徑40 cm，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。再加入生理鹽水1 ml，混勻，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃ 加熱10 min，加熱后迅速冷卻(置于-20 ℃冰箱)10 min，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心2 min，將上清液加入含有混勻試劑的PCR管中，蓋好管蓋，以離心半徑40 cm，10 000 r/min 離心5 s，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；反應(yīng)程序：63 ℃，反應(yīng)時(shí)間45 min(恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀型號(hào)：Deaou-308C)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：若擴(kuò)增曲線呈“S”型，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；如果擴(kuò)增曲線不呈“S”型，是一條直線或傾斜的直線，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即不含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

3. 涂片法：將剩余的所有充分液化的痰標(biāo)本轉(zhuǎn)入液基夾層杯(液基夾層杯由湖南天騎生物科技有限公司生產(chǎn))中，再加入適量的液基專用消化液(不能超過20 ml)，將夾層杯置于干片機(jī)中60 ℃滅活10 min，再將其置于離心機(jī)中，以離心半徑20 cm，4500 r/min離心5 min，脫蓋輕緩棄去所有上清液，置干片機(jī)中60 ℃干片8 min，滴加染液A完全覆蓋住基膜，置于干片機(jī)中60 ℃熱染5 min，棄掉A液，用水緩慢沿杯壁沖洗2遍，滴加B液5～10滴，脫色90 s，用水緩慢沖洗2遍，脫色2次直至殘余的A液脫完，滴加C液5～10滴復(fù)染1～5 min，棄去C液，緩水沖洗2次，用取片針將夾層杯內(nèi)底膜頂出，用鑷子夾出基片，靠近杯底的一面朝上，用吸水紙吸干表面水分。滴一滴中性膠于玻片，菌膜朝下封片。滴加鏡油，使用顯微鏡100倍油鏡閱片。

4.陽(yáng)性菌株的菌種鑒定：將運(yùn)送到湖南省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性菌株進(jìn)行涂片染色，挑取抗酸染色結(jié)果為陽(yáng)性的適量菌落至裝有生理鹽水和玻璃珠的磨菌瓶中，振蕩混勻成菌液，靜置15 min 后，用無(wú)菌滴管吸取0.1 ml到對(duì)硝基苯甲酸(PNB)上，置溫箱培養(yǎng)1個(gè)月后觀察結(jié)果。若PNB培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，提示為非結(jié)核分枝桿菌；若無(wú)菌落生長(zhǎng)，提示為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。同時(shí)吸取0.1 ml滴到MPB64抗原檢測(cè)板上，15 min后觀察結(jié)果，檢測(cè)板只有1條紅色的線為陰性，即提示非結(jié)核分枝桿菌或者少量MPB64抗原陰性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；出現(xiàn)2條紅色的線為陽(yáng)性，即提示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。最后，將PNB陽(yáng)性、MPB64陰性，PNB陰性、MPB64陰性，PNB陽(yáng)性、MPB64陽(yáng)性的菌株分別提取DNA，將DNA送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，最終確定是否為非結(jié)核分枝桿菌。

5.評(píng)價(jià)指標(biāo)：對(duì)比分析3種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性檢出率的差異；并以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各種檢測(cè)方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率，以及以患者進(jìn)行每項(xiàng)檢測(cè)的實(shí)際支出費(fèi)用為準(zhǔn)，計(jì)算每種方法的檢測(cè)費(fèi)用。

計(jì)算公式：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(兩種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性例數(shù)+兩種方法檢測(cè)均為陰性例數(shù))/檢測(cè)總例數(shù)×100%。

3種方法發(fā)現(xiàn)病原學(xué)陽(yáng)性患者的平均檢測(cè)費(fèi)用：每種方法的檢測(cè)費(fèi)用均按市場(chǎng)價(jià)計(jì)算，即按患者進(jìn)行上述檢測(cè)實(shí)際支出的費(fèi)用計(jì)算。液基夾層杯涂片的市場(chǎng)價(jià)為120元/例；L-J固體培養(yǎng)的市場(chǎng)價(jià)為50元/例；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)(恒溫?cái)U(kuò)增法)的市場(chǎng)價(jià)為260元/例。

三、質(zhì)量控制

項(xiàng)目研究現(xiàn)場(chǎng)的選擇嚴(yán)格按照隨機(jī)抽樣方法抽取，以最大程度地反映湖南省的情況；所有參加此項(xiàng)目的工作人員均進(jìn)行過嚴(yán)格系統(tǒng)的項(xiàng)目啟動(dòng)培訓(xùn)，掌握實(shí)施方案，項(xiàng)目實(shí)施過程中嚴(yán)格按照實(shí)施方案標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行患者納入、表格登記、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果判斷等，并同時(shí)每天做好相關(guān)儀器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)操作過程中每批測(cè)試均做陰性、陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)本的測(cè)試。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并通過雙人核實(shí)。采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3種方法兩兩之間結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢出率的比較采用配對(duì)四格表的卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05/3=0.017；3種方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率的比較，采用計(jì)算率的95%的置信區(qū)間進(jìn)行比較。

結(jié) 果

一、臨床診斷結(jié)果

628例可疑肺結(jié)核患者中，臨床最終診斷為肺結(jié)核患者153例(24.4%)；非肺結(jié)核患者475例(75.6%)，包括非結(jié)核分枝桿菌肺病6例。其中NTM肺病患者先經(jīng)過PCR檢測(cè)確定為NTM，再取患者培養(yǎng)陽(yáng)性菌株提取DNA送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，最終診斷為NTM肺病。

二、3種方法陽(yáng)性檢出率和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性檢出率情況

在肺結(jié)核可疑癥狀者中，L-J培養(yǎng)法、涂片法和恒溫?cái)U(kuò)增法的陽(yáng)性檢出率分別為14.8%(93/628)、13.9%(87/628)和12.3%(77/628)。培養(yǎng)共接種1256管，有32管污染(64管)，污染率為5.1%；剔除6例NTM肺病患者后，涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫?cái)U(kuò)增法的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性檢出率分別為13.5%(84/622)、14.0%(87/622)和12.2%(76/622)。采用配對(duì)設(shè)計(jì)的卡方檢驗(yàn)(剔除6例NTM肺病患者和32例培養(yǎng)污染的患者)，結(jié)果顯示：每?jī)煞N方法結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性檢出率之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1～3。以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算3種方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率及其95%置信區(qū)間，三者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表1 涂片法與L-J培養(yǎng)法的配對(duì)四格表

表2 L-J培養(yǎng)法與恒溫?cái)U(kuò)增法的配對(duì)四格表

表3 涂片法與恒溫?cái)U(kuò)增法的配對(duì)四格表

表4 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷3種方法檢測(cè)的診斷效能

表5 3種方法的平均檢測(cè)費(fèi)用

三、3種方法的平均檢測(cè)費(fèi)用

3種方法發(fā)現(xiàn)1例病原學(xué)陽(yáng)性患者的平均檢測(cè)費(fèi)用從高到低依次為恒溫?cái)U(kuò)增法、涂片法、L-J培養(yǎng)法。見表5。

討 論

最新版的肺結(jié)核診斷指南——《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[2]中將結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)納入了結(jié)核病病原學(xué)檢查范疇，這將對(duì)各種結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)方法提出更高的要求；傳統(tǒng)的直接涂片法簡(jiǎn)單快捷、成本低、易普及，目前仍是國(guó)內(nèi)最普遍使用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段[3]，但是其陽(yáng)性檢出率低，難以滿足臨床診斷需求，因此本研究采用涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫?cái)U(kuò)增法同時(shí)檢測(cè)疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，判斷3種不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率的差異。

本研究結(jié)果顯示，3種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以臨床診斷結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，3種方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。代小偉等[4]、宋紅煥等[5]和馬曉光等[6]的研究結(jié)果均顯示分子生物學(xué)方法的陽(yáng)性檢出率高于傳統(tǒng)涂片法，這與本研究的結(jié)果不完全一致。原因可能是：(1)不同研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法不完全相同，本研究采用的是配對(duì)設(shè)計(jì)的前瞻性研究，而部分研究則采用成組設(shè)計(jì)的回顧性研究，一般成組設(shè)計(jì)的回顧性研究存在較大的偏倚，在方法之間進(jìn)行結(jié)果的比較時(shí)，配對(duì)設(shè)計(jì)比成組設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)更有說服力；(2)所選用的分子生物學(xué)方法不完全相同，目前上市的結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)方法種類很多，不同試劑盒的檢測(cè)靶標(biāo)、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增方式和條件均不完全相同；(3)本研究采用的涂片法是液基夾層杯涂片技術(shù)，其雖也屬于涂片技術(shù)，但不同于傳統(tǒng)的涂片方法，其采用的是“集菌法”，通過離心過濾將液化后的所有痰液全部積聚在一張膜上，再經(jīng)過抗酸染色鏡下觀察，其最低檢出限值沒有數(shù)據(jù)可查，而培養(yǎng)的最低檢出限值大約為100菌落形成單位(CFU)/ml[7]，分子生物學(xué)檢測(cè)方法的最低檢出限值為10～104CFU/ml[8]，簡(jiǎn)單涂片法的最低檢出限值為103～104CFU/ml[9]，從方法原理上就能推測(cè)液基夾層杯的最低檢出限是高于傳統(tǒng)涂片法的。并且平均發(fā)現(xiàn)1例病原學(xué)陽(yáng)性患者的檢測(cè)費(fèi)用由低到高依次為L(zhǎng)-J固體培養(yǎng)、涂片法、恒溫?cái)U(kuò)增法。這提示實(shí)驗(yàn)室在這三類診斷技術(shù)方法之間做選擇時(shí)，在首要考慮各方法陽(yáng)性檢出率的基礎(chǔ)上，需綜合考慮各種方法的優(yōu)勢(shì)和局限性：液基夾層杯涂片技術(shù)操作簡(jiǎn)單，工作人員依存性高，普及程度較高，可當(dāng)天出具報(bào)告，但是只能鑒定到“是否為抗酸桿菌”的水平；L-J固體培養(yǎng)檢測(cè)費(fèi)用低，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且可獲得活菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，但是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，耗時(shí)長(zhǎng)，需5～8周時(shí)間，明顯滯后于臨床對(duì)肺結(jié)核早期診斷的期望[10]；核酸檢測(cè)生物安全程度高，可當(dāng)天出具報(bào)告，結(jié)果可鑒定到“是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群”的水平，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高并且檢測(cè)費(fèi)用較高。

因此，實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行診斷技術(shù)的選擇時(shí)，應(yīng)該綜合考慮當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室條件、試劑成本、時(shí)效性、操作依從性和結(jié)果準(zhǔn)確性等因素，選擇最適合當(dāng)?shù)氐慕Y(jié)核病診斷技術(shù)。如果在經(jīng)濟(jì)差的地區(qū)，尤其在基層地區(qū)，建議傾向選擇使用液基夾層杯涂片和L-J固體培養(yǎng)；若在經(jīng)濟(jì)條件好、實(shí)驗(yàn)室條件允許的地區(qū)，可根據(jù)情況同時(shí)使用液基夾層杯涂片、L-J固體培養(yǎng)和結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)，從而保證更快、更準(zhǔn)確地獲得檢測(cè)報(bào)告。