張藍月 耿藝漫 賈紅彥 肖婧 李自慧 潘麗萍 孫義成 張宗德

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)是廣泛存在于細菌和古細菌等原核生物基因組中的一類小型功能性基因元件，在細菌持留性[1-2]、調(diào)節(jié)生物膜動力學和適應環(huán)境刺激[3-5]等多個方面發(fā)揮著重要作用。典型的毒素-抗毒素系統(tǒng)由不穩(wěn)定的抗毒素和穩(wěn)定的毒素組成，活性狀態(tài)下的毒素可抑制細菌生長或介導細菌程序性死亡，從而殺滅細菌，而抗毒素則抑制該過程從而達到動態(tài)平衡。

分枝桿菌屬中毒素-抗毒素系統(tǒng)的種類和數(shù)量存在很大差異。如結(jié)核分枝桿菌包含至少93個毒素-抗毒素系統(tǒng)[6]；麻風分枝桿菌僅含有毒素假基因；而被用于研究結(jié)核分枝桿菌未知基因功能模式菌株的無致病性且代時短的恥垢分枝桿菌中[7]，目前僅驗證了4個有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)[分別為MSMEG_1277-1278(Phd/Doc)、MSMEG_4447-4448(MazEF)、MSMEG_1283-1284(vapBC)和MSMEG_5635-5634][8-10]，1個不包括毒素的抗毒素-伴侶蛋白(antitoxin-chaperone, AC)和2個預測的未驗證過功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)(MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760)[3, 6]。因此，為了解毒素-抗毒素系統(tǒng)與分枝桿菌耐受和持留的關(guān)系[11]，本研究通過構(gòu)建恥垢分枝桿菌2個預測毒素-抗毒素系統(tǒng)過表達體系及敲除菌株探究其功能，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能提供分子工具和線索。

材料和方法

一、材料來源

用于本研究的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

二、主要試劑和儀器

溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養(yǎng)基，米氏肉湯分枝桿菌培養(yǎng)基(Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基)或7H10固體培養(yǎng)基(美國BD公司)；BamHⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶及T4連接酶(美國NEB公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(德國Qiagen公司)；電穿孔儀(美國Bio-Rad 公司)；crRNA由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成?？股丶捌湎鄳K濃度：卡那霉素(Km)25 μg/ml；潮霉素(Hyg) 50 μg/ml；脫水四環(huán)素鹽酸鹽(ATc) 100 ng/ml；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal) 20 mg/ml。

表1 用于本研究的菌株和質(zhì)粒的特點與來源

表2 用于本研究的引物及其序列

續(xù)表2

三、研究方法

1.毒素-抗毒素系統(tǒng)基因的克隆表達及功能檢測：分別將毒素基因MSMEG_3436、MSMEG_6760和毒素-抗毒素基因?qū)SMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760進行PCR擴增，再將PCR片段克隆入由誘導劑(ATc)誘導的pYC601載體啟動子下游，經(jīng)測序驗證共構(gòu)建5個克隆(即pYC601-con、pYC601-Ms_3436、pYC601-Ms_6760、pYC601-Ms_3435-3436、pYC601-Ms_6762-6760)。將5個克隆分別電轉(zhuǎn)至恥垢分枝桿菌中，以pYC601-con空載體為對照，通過在7H9液體培養(yǎng)基中添加ATc以誘導基因表達并檢測其功能。具體操作為：挑取單克隆搖至細菌的生長狀態(tài)穩(wěn)定期，再經(jīng)1∶100轉(zhuǎn)接2次使菌株狀態(tài)一致。將溶液在600 nm波長處的吸光度值(A600)≈1.0的菌液分別轉(zhuǎn)接到100 ml含ATc (100 ng/ml)和不含ATc的7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，使初始A600≈0.02，然后在36 h內(nèi)每間隔4 h測1次A600值，再以吸光度值為縱坐標、時間為橫坐標繪制生長曲線。為使實驗達到較好的平行性，該實驗獨立重復3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

2.敲除菌株生存能力鑒定及抗生素脅迫：應用CRISPR-Cas12a基因編輯技術(shù)構(gòu)建敲除菌株[15]。根據(jù)靶標基因(MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760)設計靶標序列crRNA并連接到pCR-Hyg質(zhì)粒載體上。以恥垢分枝桿菌野生型MC2155基因組DNA為模板，PCR擴增上下游同源臂，應用吉爾伯森克隆技術(shù)(Gibson Assembly法)連接到pUC19-Amp質(zhì)粒載體上，并以此為模板將PCR擴增出來的上下游同源臂(≈1 kb)作為雙鏈DNA模板。將crRNA(100 ng)和同源臂片段(700 ng)同時電轉(zhuǎn)至SY3807感受態(tài)細胞中，30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d 后挑取單克隆測序驗證。驗證成功的突變菌株接種至7H9液體培養(yǎng)基中，1∶100轉(zhuǎn)接2次后采用紫外分光光度計測A600，繪制野生株、各個突變菌株(ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760)的生長曲線。將異煙肼和利福平分別加到20 ml野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變株的指數(shù)中期(A600≈0.3)培養(yǎng)液中，使終濃度分別為96 μg/ml和40 μg/ml。分別在加藥后即刻及加藥后24 h取樣，將每個樣品用不含抗生素的7H9洗兩遍后，再用7H9液體培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋至106倍，37 ℃倒置培養(yǎng)60 h后觀察菌株的生長狀況(菌落形成單位，CFU)并計算存活率[存活率(%)=處理24 h的CFU/處理前的CFU×100%]。再以存活率為縱坐標，抗生素名稱為橫坐標，繪制柱狀圖。為使實驗達到較好的平行性，該實驗獨立重復3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

3.LacZ報告基因的整合及啟動子活性檢測：根據(jù)文獻[8-10]及本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn)的恥垢分枝桿菌中1對新的有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，共計選擇5對有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)(MSMEG_1277-1278、MSMEG_1283-1284、MSMEG_3435-3436、MSMEG_4447-4448、MSMEG_5635-5634)來驗證毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能。PCR擴增含上游同源臂+LacZ+hyg+下游同源臂的片段(≈6 kb)，電擊轉(zhuǎn)化該載體片段(700 ng)到SY3126(含pJV53-gfp)感受態(tài)細胞中，復蘇后涂到含40 μl X-gal(20 mg/ml)的hyg+kana抗性的7H10固體培養(yǎng)基上，3～4 d后挑選藍色菌落并測序驗證。同時，采用同源重組的方法構(gòu)建5個突變菌株(即SY3328、SY3309、SY6407、SY3310、SY3311)[14]，并將PCR擴增的5對毒素-抗毒素系統(tǒng)的抗毒素基因(即MSMEG_1277、MSMEG_1283、MSMEG_3435、MSMEG_4447、MSMEG_5635)的開放閱讀框(ORF)和基因上游約500 bp(包含啟動子)的堿基序列克隆入pMV261，以構(gòu)建高表達抗毒素基因的穿梭質(zhì)粒載體，將pMV261-con和pMV261-MSMEG_1277分別電轉(zhuǎn)至SY3328突變菌株中(另外4個突變菌株用同樣的方式驗證)。當A600≈1.0時，采用紫外分光光度計測定A550和A420，計算β-半乳糖苷酶活性[酶活性單位為“Miller單位(MU)”][β-半乳糖苷酶活性=1000×(A420-1.75×A550)/反應時間(min)×A600×菌量(ml)][16]。以β-半乳糖苷酶活性為縱坐標，突變菌株名稱為橫坐標，繪制柱狀圖。為使實驗達到較好的平行性，該實驗獨立重復3次，取其中1次的數(shù)據(jù)做圖。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、恥垢分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定及功能檢測

恥垢分枝桿菌中MSMEG_3435-3436、MSMEG_6762-6760基因排列見圖1。與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對照組菌株相比，無ATc誘導時，表達MSMEG_3436和MSMEG_3435-3436、MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長(圖2，4)；而有ATc誘導時，表達MSMEG_3436的菌株幾乎沒有生長，表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，但表達MSMEG_3435-3436的菌株可正常生長(圖3)，而誘導表達MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均未可正常生長(圖5)。

二、敲除菌株生存能力鑒定及抗生素脅迫

crRNA序列見表2。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果顯示，成功獲得ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760基因敲除突變菌株，瓊脂糖凝膠電泳驗證見圖6，驗證引物及刪除片段大小見圖注。與野生株相比，ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760突變菌株的生長表型均無明顯差異(圖7)。經(jīng)驗證ΔMSMEG_6762-6760是一對無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，故未檢測其與藥物間耐藥的相關(guān)性，僅對ΔMSMEG_3435-3436突變菌株與異煙肼和利福平耐藥的相關(guān)性進行驗證。野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在加藥處理前及經(jīng)異煙肼和利福平處理24 h后的菌落形成單位即存活率見表3，加藥處理后的野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株的菌落形成單位和存活率間的差異均無統(tǒng)計學意義(表3，圖8)。

MSMEG_3434和MSMEG_6761為上游基因，MSMEG_3435和MSMEG_6762為抗毒素基因，MSMEG_3436和MSMEG_6760為毒素基因，MSMEG_3437和MSMEG_6763為下游基因圖1 基因排列示意圖

CONTROL為pYC601載體空白對照，(-)為未加ATc誘導，(+)為加ATc誘導，ATc 濃度為100 ng/ml；“A600值”指在波長600 nm處所測的吸光度值。圖2為與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對照組菌株相比，無ATc誘導時，表達MSMEG_3436和MSMEG_3435-3436的菌株均正常生長。圖3 為有ATc誘導時，誘導表達MSMEG_3436的菌株幾乎沒有生長，誘導表達MSMEG_3435-3436的菌株可正常生長圖2，3 恥垢分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)MSMEG_3435-3436對細菌生長的功能鑒定

CONTROL為pYC601載體空白對照，(-)為未加ATc誘導，(+)為加ATc誘導，ATc 濃度為100 ng/ml；“A600值”指在波長600 nm處所測的吸光度值。圖4為與電轉(zhuǎn)空載體pYC601對照組菌株相比，無ATc誘導時，表達MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長。圖5為有ATc誘導時，誘導表達MSMEG_6760和MSMEG_6762-6760的菌株均可正常生長圖4，5 恥垢分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)MSMEG_6762-6760對細菌生長的功能鑒定

菌株類型菌落形成單位(CFU,x±s)處理后存活率(%,x±s)處理前(×105)異煙肼處理后(×105)利福平處理后(×104)異煙肼處理后利福平處理后野生株126.70±13.335.33±1.761.80±0.464.38±1.480.15±0.04突變株266.70±6.67 9.33±1.760.33±0.133.49±0.660.03±0.02t值9.3911.6043.0510.5482.663P值0.0010.1840.0380.6130.056

泳道M為Trans 2 k Plus DNA ladder marker，即750 bp、1 kb、2 kb、3 kb；泳道1為在野生型分枝桿菌上用引物MSMEG_3435 up F(MSMEG_ 3435上游同源臂正向引物)和R in Ds for MSMEG(MSMEG_ 3435下游同源臂逆向引物)3435-3436所得擴增產(chǎn)物條帶，即1999 bp；泳道2為在ΔMSMEG_3435-3436菌株上用引物MSMEG_3435 up F和R in Ds for MSMEG_3435-3436所得擴增產(chǎn)物，刪掉了959 bp；泳道3為在野生型分枝桿菌上用引物MSMEG_6760 up F和R in Ds for MSMEG_6762-6760所得擴增產(chǎn)物條帶，即1824 bp；泳道4為在ΔMSMEG_6762-6760菌株上用引物MSMEG_6760 up F和R in Ds for MSMEG_6762-6760所得擴增產(chǎn)物，刪掉了792 bp圖6 應用CRISPR-Cas12a輔助的重組系統(tǒng)構(gòu)建ΔMSMEG_3435-3436、ΔMSMEG_6762-6760突變菌株

三、LacZ融合轉(zhuǎn)錄調(diào)控及啟動子活性檢測

將pMV261空載體和pMV261-antitoxin系列質(zhì)粒(即pMV261-MSMEG_1277、pMV261-MSMEG_1283、pMV261-MSMEG_3435、pMV261-MSMEG_4447、pMV261-MSMEG_5635)分別電轉(zhuǎn)至經(jīng)測序驗證成功整合LacZ報告基因的5個突變菌株(即SY3328、SY3309、SY6407、SY3310、SY3311)中。生長至A600≈1.0時，用紫外分光光度計測定A600、A550和A420，計算β-半乳糖苷酶活性。與電轉(zhuǎn)pMV261空載體相比，電轉(zhuǎn)pMV261-antitoxin系列質(zhì)粒的5個突變菌株中，抗毒素蛋白對啟動子活性的抑制程度差異均無統(tǒng)計學意義(表4)。

WT為野生型恥垢分枝桿菌，ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760分別為MSMEG_3435-3436和MSMEG_6762-6760的突變株。圖7為與野生株相比，兩個突變株的生長表型均與野生型菌株無差異。 圖8為野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在異煙肼和利福平處理24 h后(抗生素脅迫)的生存率比較，為直觀顯示縱坐標采用log10轉(zhuǎn)換后表示圖7，8 野生株和ΔMSMEG_3435-3436突變菌株在生長表型和抗生素脅迫方面的差異

菌株吸光度值A(chǔ)600值(x±s)A420值(x±s)A550值時間(min)β-半乳糖苷酶活性(MU,x±s)t值P值SY3328:: con1.025±0.0060.662±0.0290.0485.0376.50±17.132.2720.086SY3328:: MSMEG_12770.991±0.0270.550±0.0250.047 5.0315.50±20.71SY3309:: con1.018±0.0160.318±0.0150.0504.0189.00±12.241.7950.147SY3309:: MSMEG_12831.067±0.0140.297±0.0070.0524.0160.70±9.89SY6407:: con0.819±0.0060.480±0.0210.04718.0225.20±9.951.3190.258SY6407:: MSMEG_34350.815±0.0030.476±0.0060.04719.0211.70±2.57SY3310: con0.932±0.0310.417±0.0220.047 5.5221.40±12.071.9490.123SY3310: MSMEG_44470.839±0.0290.317±0.0180.0475.0186.60±13.17SY3311:: con0.988±0.0010.402±0.0130.048 6.0179.10±5.872.5620.063SY3311:: MSMEG_56350.944±0.0370.290±0.0300.052 5.5127.70±19.21

討 論

毒素-抗毒素系統(tǒng)在細菌中的生物學功能是當前研究的熱點。結(jié)核分枝桿菌至少含有93個預測的毒素-抗毒素系統(tǒng)[3]，包括RelBE、MazEF、ParDE、VapBC、HigBA、YefM/YoeB等家族，這些毒素-抗毒素系統(tǒng)可能與細菌生長速率、長期休眠和耐藥性相關(guān)[3]，但由于涉及大量的基因，目前尚沒有研究直接通過基因缺失來評估整體毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能。根據(jù)生物信息學預測和實驗研究結(jié)果顯示，恥垢分枝桿菌至少含有7個毒素-抗毒素系統(tǒng)，數(shù)量遠遠少于結(jié)核分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)，可能與結(jié)核分枝桿菌的耐受和持留密切相關(guān)[10, 17]，故認為對恥垢分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究，對于認識分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)有重要作用。

據(jù)Tandon等[17]報道，Rv0366c-Rv0367c是結(jié)核分枝桿菌中非典型的PezAT樣毒素-抗毒素系統(tǒng)，在恥垢分枝桿菌中Rv0366c的過表達可誘導其抑菌作用，并且該生長缺陷可以通過同源抗毒素Rv0367c的共表達后得以恢復，誘導表達Rv0366c使細菌長度縮短，并對乙胺丁醇的耐受性增強，經(jīng)同源性分析表明，恥垢分枝桿菌的MSMEG_3435-3436是一個預測的毒素-抗毒素系統(tǒng)，但其功能目前沒有文獻報道。Bajaj等[18]報道了MSMEG_6760的晶體結(jié)構(gòu)，并預測MSMEG_6760與處于同一操縱子調(diào)控的MSMEG_6762是一個毒素-抗毒素系統(tǒng)?；诮Y(jié)構(gòu)預測顯示，MSMEG_6762-6760與Rv2034-2035具有同源性[3]。本研究通過在液體培養(yǎng)基中加入一定濃度的四環(huán)素來誘導表達MSMEG_3436，顯示出明顯的毒性作用，導致細菌生長受到抑制，但當與其同源抗毒素MSMEG_3435共表達時，MSMEG_3436的毒素作用被中和，首次證明了MSMEG_3435-3436是一個有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)；而誘導表達MSMEG_6762-6760后，沒有顯示出毒性作用，證明了MSMEG_6762-6760是一個無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，成為第一次在恥垢分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究。由于本研究過表達所用的啟動子是誘導型的，蛋白表達較高，盡管不能完全排除重組構(gòu)建后目的基因并未表達的情況，但是大量研究都是通過在恥垢分枝桿菌及大腸桿菌中應用誘導型啟動子來驗證毒素-抗毒素系統(tǒng)的基因功能，已經(jīng)報道的Rv0229c、Rv0569、Rv2165c等都是結(jié)核分枝桿菌中無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)[3, 6, 8]，提示恥垢分枝桿菌中也可能存在無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。

為了更好地研究毒素-抗毒素系統(tǒng)在恥垢分枝桿菌中的功能，本研究應用了CRISPR-Cas12a基因編輯技術(shù)構(gòu)建了ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760基因敲除突變菌株。與野生株相比，在液體培養(yǎng)基中檢測其生長曲線，發(fā)現(xiàn)單個毒素-抗毒素系統(tǒng)的缺失不會影響其生長表型，同F(xiàn)rampton等[10]的研究報道一致，他們分別構(gòu)建了ΔvapBC，ΔmazEF，Δphd/doc敲除菌株也均未檢測到表型差異，說明單個毒素抗毒素系統(tǒng)的缺失可能不會影響細菌的生長表型。在進一步的研究中，筆者挑選了ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株，通過添加高濃度的異煙肼和利福平來驗證毒素-抗毒素系統(tǒng)與藥物耐受間的關(guān)系。雖然恥垢分枝桿菌對這兩種一線抗結(jié)核藥物天然耐藥，但其天然耐藥的機制仍未明確。筆者認為，研究異煙肼和利福平在恥垢分枝桿菌中天然耐藥的分子機制，可以為闡明異煙肼和利福平在結(jié)核分枝桿菌中的耐藥分子機制提供新的線索，而且有可能發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌天然耐藥的機制與其毒素-抗毒素系統(tǒng)是否相關(guān)的問題。研究結(jié)果顯示，高濃度異煙肼和利福平對野生株和ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株均有95%以上的殺菌作用。通過比較加藥處理前后的存活率表明，野生株和ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株與異煙肼(藥物靶點：分枝菌酸生物合成)和利福平(藥物靶點：RNA合成)耐受均無明顯關(guān)系。Frampton等[10]還研究了高濃度鏈霉素(藥物靶點：多肽的生物合成)和利福平對刪除了3個毒素-抗毒素系統(tǒng)的突變菌株(ΔMSMEG_1277-1278+ ΔMSMEG_1283-1284+ ΔMSMEG_4447-4448)的藥物耐受情況，結(jié)果顯示毒素-抗毒素系統(tǒng)與這兩種抗生素耐受無關(guān)。也有研究表明，當毒素基因過表達時，細菌持留性增強進而促進細菌產(chǎn)生耐藥性，而在缺失毒素-抗毒素系統(tǒng)的突變菌株中持留性是減弱的[19]。這提示我們，通過構(gòu)建過表達菌株、增加藥物種類等方式可以進一步優(yōu)化實驗，可以通過更多的研究來確定毒素-抗毒素系統(tǒng)與藥物耐受的關(guān)系。

截至目前，在恥垢分枝桿菌中共計鑒定出7個毒素-抗毒素系統(tǒng)。除了MSMEG_2143-2144不含毒素基因和MSMEG_6762-6760是一個無功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)，共計驗證出5個有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。本研究利用LacZ報告基因檢測啟動子活性(β-半乳糖苷酶活性)來研究毒素-抗毒素系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的負自動調(diào)節(jié)。諸多文獻報道，典型的毒素-抗毒素系統(tǒng)的表達受毒素-抗毒素復合物的調(diào)節(jié)，該復合物中的抗毒素與相關(guān)啟動子DNA相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄，導致毒素-抗毒素系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的負自動調(diào)節(jié)[8, 20-21]。Robson等[9]和Frampton等[10]的研究認為，在恥垢分枝桿菌中抗毒素基因的表達可以抑制啟動子的活性，但局限性在于該研究不是對基因組原位的驗證，而是在質(zhì)粒上構(gòu)建并通過外源轉(zhuǎn)入。為評估恥垢分枝桿菌中抗毒素蛋白與其自身啟動子結(jié)合的特性，本研究以LacZ為報告基因，在染色體上檢測了這5個毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能。與對照組相比，抗毒素表達載體僅輕微抑制了毒素-抗毒素系統(tǒng)的啟動子活性，說明在恥垢分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能不明顯，與Robson等[9]和Frampton等[10]的實驗報道結(jié)果一致。雖然也有許多對其他菌屬自調(diào)控功能的研究，如腸炎鏈球菌的TacT介導的TacA乙?；瘯淖僒acAT的啟動子結(jié)合模式，但似乎并不影響對基礎(chǔ)TacAT的轉(zhuǎn)錄水平[22]；還有對AtaRT-操縱基因DNA復合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，提示異六聚體排列對于轉(zhuǎn)錄自調(diào)控也是至關(guān)重要的[23]。但對分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能的分子機制尚不清楚，還需要進行更深入的研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MSMEG_3435-3436和MSMEG_6762-6760的表達體系及敲除菌株，發(fā)現(xiàn)MSMEG_3435-3436是恥垢分枝桿菌中一對新的有功能的毒素-抗毒素系統(tǒng)。初步探討了這兩對毒素-抗毒素系統(tǒng)對菌株生長表型及與對異煙肼和利福平耐受的相關(guān)性，驗證了恥垢分枝桿菌中5對毒素-抗毒素系統(tǒng)的自調(diào)控功能，為下一步研究結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的功能奠定了基礎(chǔ)。