虞慧華，藺紅偉，陸文銓，陳萬(wàn)生，樸淑娟*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所，同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡等生命活動(dòng)具有十分重要的調(diào)控作用。任何通過(guò)直接或間接作用損傷線粒體結(jié)構(gòu)和功能，即引起線粒體毒性的藥物均可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，輕則導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、局部組織細(xì)胞凋亡或壞死，重則引起器官衰竭甚至死亡[1]。一些抗病毒藥、降脂藥、降糖藥、抗生素、解熱鎮(zhèn)痛藥和化療藥物等均因線粒體毒性受到美國(guó)食品藥品管理局(FDA)“黑框”警告或被迫撤出市場(chǎng)。基于此，藥物引發(fā)的線粒體毒性引起了醫(yī)藥界與監(jiān)管部門的廣泛關(guān)注和高度重視。歐盟藥品評(píng)價(jià)管理局、美國(guó)FDA等機(jī)構(gòu)推薦或明確要求藥物研發(fā)過(guò)程中應(yīng)評(píng)價(jià)藥物對(duì)線粒體的毒性作用[2]。

毒性評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)方法主要是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)解剖檢查、稱量重量、計(jì)算臟器指數(shù)、血液生化學(xué)檢查及病理形態(tài)學(xué)檢查等來(lái)發(fā)現(xiàn)受試物的器官毒性，即使用嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行不同時(shí)間段的生物測(cè)定。雖然這種方法在評(píng)估化合物對(duì)人類潛在危害的應(yīng)用中發(fā)揮了重要的作用，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其局限性也逐漸顯露出來(lái)[3]。動(dòng)物體內(nèi)模型通常通量低，價(jià)格昂貴且耗時(shí)比較長(zhǎng)。體外毒性評(píng)價(jià)由于周期短、成本低和作用機(jī)制易于探明等優(yōu)勢(shì)得到快速的發(fā)展，自動(dòng)化的高通量檢測(cè)與篩選更是得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。

高通量篩選(high throughput screening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏、快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)份樣品進(jìn)行檢測(cè)并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系[6]。目前，高通量毒性評(píng)價(jià)已成為毒理學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并且在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都發(fā)揮著重要的作用。高通量體外篩選，通常比用體內(nèi)模型進(jìn)行的分析更有效且更便宜，更利于多種化合物的活性篩選[7]。本文對(duì)線粒體毒性評(píng)價(jià)中應(yīng)用HTS技術(shù)進(jìn)行的檢測(cè)方法和手段進(jìn)行介紹，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供一定的參考信息。

1 依據(jù)線粒體毒性發(fā)生機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)

HTS分析的第一步是明確檢測(cè)目標(biāo)的生物學(xué)機(jī)制和化學(xué)評(píng)估系統(tǒng)。線粒體毒性機(jī)制包括破壞線粒體膜電位、線粒體形態(tài)和生物功能等[8]。檢測(cè)線粒體毒性應(yīng)根據(jù)線粒體損傷機(jī)制來(lái)選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。

1.1 線粒體探針 線粒體探針是指能夠特異性抑制線粒體蛋白的化合物，可用于檢測(cè)線粒體的功能。最常用的線粒體探針包括哇巴因、魚藤酮、抗霉素A、寡霉素和三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP)。哇巴因通過(guò)與酶結(jié)合而抑制Na+/K+-ATPase并引起細(xì)胞內(nèi)鈉的增加，線粒體腫脹和耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)的降低。魚藤酮通過(guò)阻止電子從鐵硫轉(zhuǎn)移到泛醌而抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ[9]?？姑顾谹抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ中細(xì)胞色素C還原酶，阻止泛醌的氧化并破壞線粒體質(zhì)子梯度[10]。寡霉素抑制ATP合成酶的Fo亞基，阻止ADP磷酸化合成ATP，減少電子沿電子傳遞鏈的流動(dòng)。FCCP是一種質(zhì)子載體，運(yùn)輸氫離子通過(guò)細(xì)胞膜，使ATP的產(chǎn)生與氧消耗解偶聯(lián)，導(dǎo)致最大OCR。

這些線粒體探針可以通過(guò)各種檢測(cè)技術(shù)單獨(dú)使用或組合使用，以識(shí)別線粒體功能障礙的來(lái)源。如使用寡霉素可揭示直接由ATP產(chǎn)生的線粒體呼吸量；使用FCCP能夠確定細(xì)胞的最大呼吸能力與基礎(chǔ)呼吸之間的差異；使用抗霉素A、魚藤酮和哇巴因可完全破壞線粒體呼吸，從而揭示非線粒體的細(xì)胞呼吸量。

1.2 活性氧機(jī)制 線粒體功能障礙通常會(huì)增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致炎癥、神經(jīng)變性和衰老。ROS包括超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫和單態(tài)氧。在正常的生理?xiàng)l件下，ROS的產(chǎn)生和清除受到嚴(yán)格控制，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。破壞線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可導(dǎo)致ROS產(chǎn)生失衡[11]?；钚曰衔飼?huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)、外脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷。有許多方法可以測(cè)量ROS，包括化學(xué)發(fā)光法、熒光探針?lè)ê兔富钚詼y(cè)定法等[12]。最適用于HTS的檢測(cè)方法是使用可滲透熒光ROS指示劑，包括dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，hydroethidine和線粒體超氧化物熒光探針MitoSOX Red(mito-hydroethidine)[12-13]。

上述許多探針不會(huì)直接與ROS反應(yīng)形成熒光產(chǎn)物，從而限制了ROS的直接測(cè)定。此外，在細(xì)胞內(nèi)，除線粒體外還有許多ROS來(lái)源，因此不能單獨(dú)以ROS測(cè)定結(jié)果來(lái)判定線粒體功能。

1.3 膜電位機(jī)制 線粒體跨膜產(chǎn)生的電化學(xué)梯度是生成ATP不可或缺的因素，線粒體毒性的一種機(jī)制即為破壞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)。四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針(DiOC6)、線粒體膜電位熒光探針(JC-1)是親脂性陽(yáng)離子染料，由于這些染料帶正電荷，它們?cè)诰€粒體內(nèi)的積累與MMP成反比[14]。通過(guò)將線粒體暴露于上述熒光劑之一來(lái)評(píng)估化合物對(duì)MMP的影響，使用熒光酶標(biāo)儀可對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。熒光成像技術(shù)是線粒體HTS最廣泛使用的技術(shù)，大多數(shù)微孔板讀板器可容納96和384孔板，并具有測(cè)量熒光吸收和發(fā)光的能力，使用熒光探針定量檢測(cè)MMP破壞的方法已被證實(shí)為評(píng)估線粒體毒性的有效方法[15]。

熒光探針定量檢測(cè)MMP作為評(píng)估線粒體功能的方法具有較多優(yōu)勢(shì)，但是在分析結(jié)果時(shí)要考慮諸多因素。這些探針可測(cè)量跨膜電荷的變化，但無(wú)法特異性地測(cè)量質(zhì)子梯度。為了對(duì)結(jié)果進(jìn)行有效分析，研究人員必須選擇正確的染料，以正確的方法觀察細(xì)胞，并需要利用適當(dāng)?shù)膶?duì)照來(lái)確認(rèn)。此外，除測(cè)定MMP外，還需補(bǔ)充測(cè)定，如補(bǔ)充測(cè)定細(xì)胞中的ATP水平和OCR等。

1.4 呼吸測(cè)定法 呼吸測(cè)定技術(shù)在毒理學(xué)研究中可以評(píng)估毒性物質(zhì)對(duì)代謝和線粒體適應(yīng)性的影響。通過(guò)觀察線粒體DNA和酶活性來(lái)量化線粒體功能的許多檢測(cè)模型在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)破壞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或組織，而呼吸測(cè)定法可使用熒光細(xì)胞生存力測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞ATP含量來(lái)間接評(píng)估線粒體功能。在Mg2+、ATP和O2存在的情況下，熒光素被熒光素酶氧化，產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)與細(xì)胞產(chǎn)生的ATP的量成正比，可以使用酶標(biāo)儀來(lái)定量。通過(guò)測(cè)定ATP的含量來(lái)檢測(cè)細(xì)胞生存力和線粒體功能在HTS模型中已廣泛使用[16]。最直接的呼吸測(cè)定法是測(cè)量OCR。OCR的測(cè)量是非侵入性的，可以在孤立的線粒體或組織樣本中測(cè)定，在某些情況下還可用于整個(gè)生物體的測(cè)定。Clark電極和Oroboros儀器已被廣泛用于呼吸測(cè)定法。然而，這些方法一次只能檢查少量樣品，重復(fù)性也不理想。使用Seahorse 24孔和96孔細(xì)胞外通量分析儀(XF-24和XF-96，Seahorse生物科技公司)使呼吸測(cè)定的HTS成為可能[17]。這項(xiàng)技術(shù)可以對(duì)OCR和細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)的微小變化進(jìn)行靈敏的測(cè)定。

接觸有毒物質(zhì)后，線粒體基礎(chǔ)呼吸的變化很難確定，也無(wú)法獲得有關(guān)線粒體最大呼吸容量下降的信息。XF-96分析儀允許在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注入化學(xué)探針，從而能夠更具體地分析出線粒體的干擾來(lái)源。通過(guò)依次加入ATP合酶抑制劑寡霉素、質(zhì)子解偶聯(lián)劑FCCP、電子傳遞鏈抑制劑魚藤酮和抗霉素A，XF-96能給出線粒體基礎(chǔ)呼吸、ATP周轉(zhuǎn)率、質(zhì)子泄漏、偶聯(lián)效率、最大呼吸率、備用呼吸容量和非線粒體呼吸等信息，可以用來(lái)確定線粒體毒性發(fā)生的特定機(jī)制[18]。加入寡霉素可以確定與ATP產(chǎn)生偶合的呼吸分?jǐn)?shù)，加入FCCP能夠使線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，從而導(dǎo)致最大呼吸，改變線粒體功能的化合物通常會(huì)導(dǎo)致最大呼吸速率顯著下降。魚藤酮和抗霉素A可以阻止電子通過(guò)電子傳遞鏈，OCR的降低提示非線粒體呼吸或電子傳遞鏈功能障礙而導(dǎo)致質(zhì)子泄漏[18]。

細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體都可以在XF儀器中測(cè)量。這項(xiàng)技術(shù)代表了高通量評(píng)估細(xì)胞線粒體功能的重大進(jìn)步，現(xiàn)已用于多種線粒體HTS分析[19]。線粒體呼吸是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，用于評(píng)估線粒體功能的化學(xué)探針也會(huì)破壞整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)胞器。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要適當(dāng)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行比較分析，以便更準(zhǔn)確地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè) 線粒體形態(tài)受融合、分裂和線粒體自噬的影響，線粒體的天然異質(zhì)性會(huì)影響細(xì)胞功能和對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性。有毒物質(zhì)的接觸可通過(guò)影響線粒體功能、形狀和數(shù)量來(lái)改變線粒體亞群的平衡。線粒體自噬是在線粒體損傷或細(xì)胞應(yīng)激后線粒體的降解和循環(huán)。線粒體自噬的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)多種方法進(jìn)行評(píng)估，包括透射電子顯微鏡、蛋白質(zhì)印跡和熒光顯微鏡[20]。HTS可以通過(guò)使用熒光探針壬基吖啶橙(NAO)來(lái)測(cè)量線粒體中心磷脂的含量，并使用TMRM或MitoTracker來(lái)確定膜電位，從而檢測(cè)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。高通量熒光顯微鏡最適合形態(tài)學(xué)HTS檢測(cè)，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用也取得了顯著進(jìn)展。流式細(xì)胞術(shù)是一種分析細(xì)胞和細(xì)胞器形態(tài)的有效方法，每秒可評(píng)估樣品中的數(shù)千個(gè)線粒體，因此流式細(xì)胞儀具有很高的通量，已被廣泛用于線粒體毒性物質(zhì)的篩選。最新式的流式細(xì)胞儀可以整合96、384和1536孔板，從而使該技術(shù)得以用于線粒體的HTS分析[21]。

流式細(xì)胞術(shù)HTS法是一種有效的線粒體形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法，但是由于頻繁使用分離的線粒體而使其具有一定的局限性，因?yàn)榫€粒體在分離過(guò)程中可能發(fā)生改變或丟失，從而使形態(tài)學(xué)的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

2 線粒體毒性評(píng)價(jià)模型

一直以來(lái)，毒理學(xué)家認(rèn)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能提示人類的某些潛在反應(yīng)，因此常常依靠嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)模型來(lái)評(píng)估藥物毒性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖然提供了有價(jià)值的毒性數(shù)據(jù)，但動(dòng)物模型通常通量很低，價(jià)格昂貴且耗時(shí)比較長(zhǎng)。用分離的細(xì)胞器或培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)也可以獲得有關(guān)毒性機(jī)制的有價(jià)值的數(shù)據(jù)[22]。體外HTS通常比在體內(nèi)模型進(jìn)行的分析更有效且更便宜，更利于多種化合物的毒性篩選。

2.1 離體線粒體檢測(cè)模型 離體線粒體檢測(cè)通常用于評(píng)估化合物對(duì)線粒體功能的影響。為了確定線粒體毒性在特定器官中的作用，可以將線粒體分離自感興趣的器官，并在化學(xué)暴露后檢查其形態(tài)和功能[23]。使用分離的線粒體來(lái)測(cè)量化合物對(duì)氧氣消耗的影響，可以避免細(xì)胞或整個(gè)生物體中存在任何非線粒體呼吸源，包括過(guò)氧化物酶體對(duì)呼吸的影響。然而，離體線粒體存在許多實(shí)驗(yàn)上的缺點(diǎn)，使其難以用于HTS毒性實(shí)驗(yàn)中。通常離體線粒體通過(guò)細(xì)胞裂解分離，然后經(jīng)過(guò)離心分離和純化，這種分離過(guò)程可能在檢測(cè)之前破壞線粒體，從而使結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，為了獲得高質(zhì)量的線粒體，需要大量的組織，并需在低于4 ℃的溫度下給藥，以維持線粒體功能。在分離的線粒體中檢測(cè)氧化磷酸化并不包括代謝和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響，因此提供的信息也并不完整。

2.2 細(xì)胞檢測(cè)模型 體外毒性模型通常使用永生化細(xì)胞系并在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。盡管方便，但這些培養(yǎng)條件導(dǎo)致細(xì)胞不能模擬在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的某些線粒體功能。許多永生化細(xì)胞系來(lái)自癌細(xì)胞，因此可能會(huì)表現(xiàn)出瓦氏效應(yīng)(Warburg effect)。癌細(xì)胞即使在充足的氧氣存在條件下，也會(huì)偏向使用糖酵解取代一般正常細(xì)胞的有氧循環(huán)[24]。因此，腫瘤細(xì)胞系對(duì)線粒體呼吸的依賴性較小，對(duì)線粒體毒物的抵抗力更強(qiáng)，這降低了它們?cè)跈z測(cè)線粒體毒性的HTS分析中的實(shí)用性。

盡管原代細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)且價(jià)格昂貴，但它們是研究化合物對(duì)線粒體功能影響的高通量分析的理想選擇。當(dāng)在供氧增加和低葡萄糖或無(wú)葡萄糖培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)時(shí)，原代細(xì)胞通常保持分化功能，并表現(xiàn)出與體內(nèi)線粒體相當(dāng)?shù)暮粑吞钱惿俾?。與嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比，人類原代細(xì)胞更能表現(xiàn)出與人類相關(guān)的線粒體毒性。

2.3 葡萄糖和半乳糖不同培養(yǎng)條件模型 永生化細(xì)胞和原代細(xì)胞的有氧呼吸水平取決于它們的培養(yǎng)條件。糖酵解只產(chǎn)生ATP的小部分。生物體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞都依賴于氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)生成能量。但是，許多癌細(xì)胞卻是糖酵解活性增強(qiáng)，乳酸生成水平較高[24]。研究表明，一些癌細(xì)胞可以根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖的水平在有氧糖酵解和氧化代謝之間切換[25]。癌細(xì)胞具有在高濃度葡萄糖環(huán)境中抑制呼吸和氧化磷酸化的能力，這種對(duì)糖酵解的偏愛效應(yīng)被稱為Crabtree效應(yīng)(又稱為葡萄糖效應(yīng))。因此，依靠糖酵解產(chǎn)生能量的細(xì)胞對(duì)線粒體擾動(dòng)的敏感性較低，這對(duì)于檢查和鑒定線粒體毒性物質(zhì)是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

解決該問(wèn)題的一種方法是在細(xì)胞培養(yǎng)基中用半乳糖替代葡萄糖。半乳糖被氧化為丙酮酸的速度比葡萄糖慢得多，迫使細(xì)胞依賴OXPHOS來(lái)產(chǎn)生必需的ATP。這種方法盡管有效，但在細(xì)胞培養(yǎng)中使用半乳糖卻有局限性，因?yàn)槟承┘?xì)胞無(wú)法分解半乳糖以產(chǎn)生能量。此外，當(dāng)OXPHOS被線粒體毒性物質(zhì)阻斷時(shí)，細(xì)胞需要糖酵解才能存活。當(dāng)細(xì)胞暴露于可破壞無(wú)葡萄糖培養(yǎng)基中OXPHOS的化合物時(shí)，它們將無(wú)法進(jìn)行糖酵解并迅速死亡，這會(huì)導(dǎo)致在長(zhǎng)時(shí)間暴露期間難以區(qū)分線粒體毒性物質(zhì)還是細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而得到假陰性的結(jié)果[26]。最近的研究試圖通過(guò)使細(xì)胞在兩個(gè)階段中生長(zhǎng)來(lái)克服Crabtree效應(yīng)，即低濃度葡萄糖的初始糖酵解階段和葡萄糖耗盡后消耗乳酸的OXPHOS階段[27]。初始培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖提供了細(xì)胞增殖所必需的營(yíng)養(yǎng)成分以維持細(xì)胞生存，而后放置于無(wú)葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞對(duì)線粒體毒性物質(zhì)的敏感性增加[28]。

3 小 結(jié)

線粒體毒性評(píng)價(jià)是每年對(duì)進(jìn)入市場(chǎng)的數(shù)百種藥品進(jìn)行有效管理的關(guān)鍵。因此，高效率、大規(guī)模的線粒體毒性分析至關(guān)重要。高通量線粒體毒性評(píng)價(jià)是在綜合傳統(tǒng)方法和新技術(shù)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)受試物線粒體毒性的高效、快速檢測(cè)以及對(duì)目標(biāo)物的高通量、有目的的檢測(cè)與篩選。當(dāng)然，HTS模型作為藥物研究的一種方法，并不是一種萬(wàn)能的手段，尤其是體外篩選模型，不可能充分、全面反映藥物的藥理作用。但通過(guò)HTS標(biāo)記為線粒體毒性的化合物可以優(yōu)先進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以用于包括嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的二級(jí)測(cè)定，以便更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)未知化合物的線粒體毒性。