董曉丹,穆素紅
腎細(xì)胞癌占成人腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的90%,腎細(xì)胞癌早期患者通常沒(méi)有明顯的臨床癥狀,當(dāng)患者確診為腎細(xì)胞癌時(shí)通常已經(jīng)發(fā)展至晚期[1-4]。因此,尋找一種療效好、不良反應(yīng)小、安全性高的治療藥物迫在眉睫。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的一種天然二酮類化合物,具有抗腫瘤活性,在肝癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤的細(xì)胞學(xué)研究中,被證實(shí)具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,以及增敏抗癌藥物活性[5-6]。本研究旨在研究姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的腎癌A498細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。
1.1材料 人腎癌A498細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心),姜黃素(sigma公司,純度97%,用無(wú)水乙醇溶解),二甲基亞砜、胎牛血清(杭州四季青公司)、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),Hoechst-PI雙染試劑盒(南京建成生物研究所),BCA蛋白測(cè)定試劑盒、PVDF膜及化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天公司),p53、p21及GAPDH抗體(上海碧云天公司)。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎癌A498細(xì)胞,青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml,培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%,每3天傳代1次,更換新鮮培養(yǎng)液,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,用胰酶消化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2腎癌A498細(xì)胞分組:細(xì)胞接種于96孔板,分4組,每組5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。姜黃素組依姜黃素濃度不同分為10、20、40 μmol/L組,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況:腎癌A498細(xì)胞接種于96孔板中,每孔200 μl細(xì)胞密度為1×105/ml,棄去原有培養(yǎng)液,將已配置含10% CCK-8的培養(yǎng)基以換液的形式加入,接種后的96孔板37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,觀察細(xì)胞已貼壁。檢測(cè)480 nm吸光度。
1.2.4細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察:我們采用Hoechst-PI染色法定量觀察細(xì)胞凋亡情況,細(xì)胞接種于6孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/ml,按照試劑盒說(shuō)明,更換細(xì)胞培養(yǎng)液并用PBS沖洗3遍,在150 μl的Binding Buffer中分別加入Hoechst(5 μl)及PI(2 μl)混勻,室溫避光反應(yīng)5 min,熒光顯微鏡下觀察、拍照并統(tǒng)計(jì)分析凋亡細(xì)胞比例。
1.2.5細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化:室溫下1%鋨酸固定細(xì)胞2 h,丙酮脫水,常規(guī)電鏡包埋,制作超薄切片,枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色,透射電鏡觀察。
1.2.6蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)腎癌A498細(xì)胞內(nèi)p53及p21蛋白表達(dá):提取蛋白質(zhì)后以Brandford法測(cè)定每個(gè)樣品蛋白濃度。加入上樣緩沖液,行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉4℃封閉2 h,加一抗(稀釋濃度1∶1000)過(guò)夜,室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2000)1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像,利用樣本目的蛋白光密度比內(nèi)參條帶光密度,比較不同樣本相對(duì)表達(dá)率。
2.1細(xì)胞增殖情況 隨姜黃素作用濃度增加,腎癌A498細(xì)胞增殖率逐漸降低,10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細(xì)胞48 h后,細(xì)胞增殖率分別為(72.00±3.61)%、(57.43±3.61)%和(34.67±3.61)%,對(duì)照組為(95.33±53.44)%。姜黃素10、20及40 μmol/L組腎癌A498細(xì)胞增殖率低于對(duì)照組,且姜黃素不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。
圖1 MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞增殖率的影響
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理;與對(duì)照組比較,bP<0.01;與10 μmol/L組比較,dP<0.01;與20 μmol/L組比較,fP<0.01
2.2姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下,對(duì)照組背景熒光暗黑色,可見(jiàn)數(shù)個(gè)散在凋亡細(xì)胞核(亮藍(lán)色強(qiáng)熒光),細(xì)胞凋亡率為(2.33±1.87)%;10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細(xì)胞后凋亡細(xì)胞數(shù)量增多,甚至出現(xiàn)紅染的壞死細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率分別為(19.00±3.74)%、(34.67±3.38)%、(75.67±5.44)%,均高于對(duì)照組,且姜黃素不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、3。
2.3姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,核仁類圓形,染色質(zhì)正常,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常,線粒體峭可見(jiàn)。10 μmol/L姜黃素作用腎癌A498細(xì)胞48 h后,細(xì)胞膜邊緣部分膨出,細(xì)胞核內(nèi)染色邊集,伴隨姜黃素作用濃度增加,部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體形態(tài)不清晰。見(jiàn)圖4。
圖2 4組腎癌A498細(xì)胞凋亡情況(×200)
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理
圖3 姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞凋亡的影響
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理;與對(duì)照組比較,bP<0.01;與10 μmol/L組比較,dP<0.01;與20 μmol/L組比較,fP<0.01
2.4姜黃素對(duì)p53及p21蛋白表達(dá)影響 10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細(xì)胞48 h后,p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(40.29±2.09)%、(99.46±6.73)%、(133.43±13.50)%,對(duì)照組為(32.53±1.87)%。姜黃素10、20及40 μmol/L組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高,且不同濃度姜黃素組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10、20及40 μmol/L姜黃素作用于腎癌A498細(xì)胞48 h后,p21蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(49.77±3.70)%、(95.93±6.13)%、(133.10±7.92)%,對(duì)照組為(23.12±4.52)%)。姜黃素10、20及40 μmol/L組p21蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高,且不同濃度姜黃素組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5、6。
圖4 姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響(×5000)
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理
圖5 4組腎癌A498細(xì)胞內(nèi)p53及p21蛋白表達(dá)情況
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理
圖6 姜黃素對(duì)腎癌A498細(xì)胞內(nèi)p53及p21蛋白表達(dá)影響
10、20、40 μmol/L組分別給予不同濃度姜黃素處理;與對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與10 μmol/L組比較,cP<0.05,dP<0.01;與20 μmol/L組比較,eP<0.05,fP<0.01
腎細(xì)胞癌首選手術(shù)治療,但由于惡性腫瘤具有侵襲性生長(zhǎng),增殖較快,與周圍正常組織間無(wú)明顯界限的特點(diǎn),手術(shù)過(guò)程中難以徹底切除,因此,化療及靶向治療在腎細(xì)胞癌治療中逐漸發(fā)揮重要作用[7-9]。治療腎細(xì)胞癌化療藥物種類較多,其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí),也抑制了人體正常細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝,使免疫系統(tǒng)遭到破壞[10-11]。化療藥物均有不同程度的毒副作用,因此,選擇一種低毒、安全的化療藥物對(duì)腎細(xì)胞癌患者預(yù)后至關(guān)重要[12-13]。
姜黃素是廣泛存在于多種中草藥中的二酮類化合物,對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞有不同程度抑制作用,姜黃素通過(guò)增加線粒體膜通透性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用,對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系、急性髓性白血病細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系均有抑制作用[14-17]。姜黃素具有低毒、價(jià)格低廉的特點(diǎn),具有廣闊的研究和應(yīng)用前景[18-20]。近年來(lái),有學(xué)者將姜黃素應(yīng)用于人腎癌Caki-2細(xì)胞,顯示了姜黃素通過(guò)抑制H-Ras蛋白表達(dá)、直接或間接下調(diào)ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá),從而誘導(dǎo)Caki-2細(xì)胞凋亡[21]。
CCK-8法主要用于細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖率的檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示,姜黃素對(duì)人腎癌A498細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,腎癌細(xì)胞增殖率隨姜黃素濃度的增加而降低,呈一定的劑量依賴性。為了驗(yàn)證姜黃素對(duì)腎癌細(xì)胞A498凋亡的促進(jìn)作用,我們采用Hoechst PI核染色法觀察細(xì)胞凋亡情況,正常細(xì)胞核的Hoechst著色呈淡藍(lán)色,凋亡早期及中期細(xì)胞核由于核染色質(zhì)濃集呈亮藍(lán)色,可見(jiàn)核邊集或碎片,處于凋亡晚期或壞死期的細(xì)胞核可被PI染料著色,熒光顯微鏡下呈紅色。本研究結(jié)果顯示,姜黃素干預(yù)腎癌A498細(xì)胞后,凋亡及壞死細(xì)胞明顯增多,證實(shí)姜黃素可以劑量依賴性促進(jìn)腎癌A498細(xì)胞凋亡。
研究指出,姜黃素可以激活凋亡前體蛋白p53和其下游效應(yīng)物p21抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的增殖[22]。為了進(jìn)一步明確姜黃素抑制腎癌A498細(xì)胞活性的具體機(jī)制,我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)凋亡前體蛋白p53和其下游效應(yīng)物p21的蛋白表達(dá)情況。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,姜黃素能激活p53表達(dá),上調(diào)p21蛋白表達(dá)水平。
綜上所述,本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用姜黃素治療腎癌提供了理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù),但治療效果以及藥物治療濃度仍待大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證明。