鄧慧敏，張 琰，宋春麗 綜述，周義文 審校

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳 518000

全世界有超過2.4億人感染乙型肝炎病毒(HBV)，15%～40%的未接受治療的慢性HBV感染者可進展為肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭和肝癌[1-2]。HBV是大小約為3.2 kb的部分環(huán)狀雙鏈DNA，其在DNA聚合酶作用下可轉(zhuǎn)化形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。肝細胞中的兩個高活性啟動子EnhancerⅠ(En1)、 EnhancerⅡ(En2)與肝細胞表面表達的特異性受體蛋白及細胞內(nèi)富集的各類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子共同決定了HBV的嗜肝特性[3]。想通過藥物徹底消滅慢性HBV攜帶者體內(nèi)的全部病毒十分困難，因此，尋找新的HBV檢測標志物長鏈非編碼RNA(lncRNA)在早期診斷HBV感染及調(diào)控HBV的復(fù)制過程有著重要的意義。

近十年的研究結(jié)果支持將大于200個核苷酸的非編碼RNA(ncRNA)稱為lncRNA，其占ncRNA總量的80%以上，多由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成。根據(jù)lncRNAs與臨近蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)關(guān)系，分為以下5類：(1)正義鏈或反義鏈；(2)雙向的lncRNAs；(3)基因間的lncRNAs；(4)增強子lncRNAs；(5)內(nèi)含子lncRNAs[4-5]。根據(jù)lncRNAs保守性差，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程的特點，推測對于感染HBV的細胞，靶向治療的關(guān)鍵點就是對基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯以及細胞核內(nèi)核外信使進行干擾[6]。因此，本文就lncRNAs的功能及其參與HBV復(fù)制的具體分子機制綜述如下：全面深入了解HBV復(fù)制相關(guān)的lncRNA肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本(HULC)、lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)、乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)相關(guān)的lncRNA DBH-AS1、lncRNA生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)、lncRNA母系印記基因3(MEG3)等對HBV復(fù)制的調(diào)控機制，進一步認識HBV持續(xù)感染的過程，發(fā)現(xiàn)抗HBV復(fù)制的新靶點。

1 高表達lncRNAs

1.1lncRNA HULC HULC定位于染色體6p24.3。因為HULC沒有開放閱讀框，故不參與相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯[7]。HBX的轉(zhuǎn)錄活性是病毒復(fù)制的必要條件，HBX的轉(zhuǎn)錄本在肝細胞中逐漸累積，可誘導(dǎo)、改變許多參與基因表達需要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，控制細胞周期，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和代謝等。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是HULC核心啟動子區(qū)域53nt-67nt位的一個結(jié)合位點，HBX可直接結(jié)合CREB上調(diào)HULC活性，抑制p18的表達水平，干擾ATM/ATR和p53信號傳導(dǎo)途徑，反式激活、增強HBV在細胞內(nèi)的復(fù)制功能[8-9]。

miR-372是一種與細胞周期調(diào)控相關(guān)的微小RNA，通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與啟動子解離，促使HULC表達降低[10]。HULC近端啟動子區(qū)域內(nèi)的CREB磷酸化后能夠“打開”并維持HULC啟動子局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其具有抑制一系列miRNA，包括miR-372活性的能力。HULC抑制miR-372導(dǎo)致其靶基因Prkacb的翻譯減少，誘導(dǎo)CREB磷酸化，磷酸化后的CREB再次激活HULC活性，增強HULC與miR-372結(jié)合，如此循環(huán)往復(fù)，構(gòu)成正反饋調(diào)節(jié)[11]。HBX與miR-372共同增強CREB轉(zhuǎn)錄因子的活性，使HULC在HBV感染患者體內(nèi)明顯增高，提示HULC的高表達可作為診斷HBV復(fù)制的血清學(xué)檢測指標，抑制肝細胞內(nèi)HBV的復(fù)制。

1.2lncRNA HOTAIR HOTAIR長度約為2 158 bp，定位于染色體12q13.13，在HOXC11與HOXC12之間。其基因包含5個短外顯子與1個長外顯子(235 bp的A和239 bp的B兩個結(jié)構(gòu)域)，HOTAIR結(jié)構(gòu)保守性相對較高，尤其是B結(jié)構(gòu)域更加保守。HOTAIR的功能部位主要集中在5′端的外顯子1′和3′端的B結(jié)構(gòu)域[12]。在HBV復(fù)制的細胞中發(fā)現(xiàn)有絲分裂polo樣激酶1(Plk1)呈高表達，兩種轉(zhuǎn)錄阻滯因子多梳蛋白SUZ12和ZNF198則低表達。此外，SUZ12是轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物PRC2的重要亞基之一，ZNF198的穩(wěn)定性由復(fù)合物(賴氨酸特異性脫甲基酶1)調(diào)節(jié),并觀察到Plk1位點特異性介導(dǎo)SUZ12和ZNF198的磷酸化，磷酸化抑制了SUZ12與PRC2的結(jié)合，破壞ZNF198與賴氨酸特異性脫甲基酶1復(fù)合物間的相互作用。HOTAIR通過交叉調(diào)節(jié)導(dǎo)致HOXD基因沉默和組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，3′端則與組蛋白脫甲基化酶復(fù)合物(LSD1/RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子、REST/REST共抑制蛋白、CoREST)相互作用使組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基化(H3K4me2)。HOTAIR就這樣作為一個支架與兩個復(fù)合物結(jié)合，靶向目的基因使染色體重排導(dǎo)致基因沉默[13]。HOTAIR的表達增強了SUZ12和ZNF198的Plk1依賴性泛素化，也增加了Plk1介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，明顯降低了SUZ12和ZNF198的穩(wěn)定性[14-15]。HBV的復(fù)制刺激了HOTAIR與Plk1的表達，支持了該機制與HBV復(fù)制的相關(guān)性學(xué)說。

1.3lncRNA DBH-AS1 DBH-AS1是一個長度約為2 kb的lncRNA，是染色體9q34轉(zhuǎn)錄的多腺苷酸化尾巴。SUDAN等[16]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠下調(diào)HepG2細胞中DBH-AS1的表達，HSIEH等[17]發(fā)現(xiàn)槲皮素能有效抑制HBX對幾種關(guān)鍵癌基因的調(diào)控，推測HBX可能通過影響DBH-AS1的表達，參與HBV的復(fù)制。DBH-AS1可上調(diào)細胞周期正向調(diào)控蛋白CDK6、CCND1和CCNE1的mRNA水平，而下調(diào)細胞周期負向調(diào)控蛋白P16、P21、P27的mRNA水平，從分子水平驗證了DBH-AS1具有促進細胞周期進程的作用。此外，通過過表達DBH-AS1可使p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白磷酸化水平增高，證明DBH-AS1具有活化MAPK通路的功能。MAPK信號傳導(dǎo)通路活化后促進cyclinD在G1期的表達，通過形成cyclinD-CDK4/CDK6復(fù)合物，加速G1/S期和G2/M過渡期，使細胞越過G1期限制點，從而促進細胞周期進程。研究還發(fā)現(xiàn)，DBH-AS1基因上游有一個類似p53的結(jié)合位點跨越了-447～-461 bp位置，抑制P53蛋白的生成，升高DBH-AS1的表達，但p53是否通過直接與DBH-AS1的啟動子區(qū)域結(jié)合仍需進一步研究[18]。P53蛋白負向調(diào)控細胞中DBH-AS1的含量，HBX與DBH-AS1的表達呈正相關(guān)。DBH-AS1上調(diào)MAPK信號通路中磷酸化的關(guān)鍵蛋白(p-ERK、p-p38、p-JNK)表達水平，加速細胞周期進程，抑制HBV DNA的核酸切除修復(fù)，促使負性生長調(diào)節(jié)因子失活，調(diào)控細胞凋亡等。

HBX是相對分子質(zhì)量約為17×103的蛋白質(zhì)，由HBVx基因編碼的154個氨基酸構(gòu)成。HBX在細胞核內(nèi)有轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動子活性和在細胞核外調(diào)節(jié)信號通路的雙重功能。HBX并不直接結(jié)合HBV基因組，而是與細胞內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，增強HBV啟動子活性，促進HBV DNA的復(fù)制。DBH-AS1與HBX、p53之間的調(diào)節(jié)不僅影響細胞周期、轉(zhuǎn)錄和凋亡相關(guān)的信號通路，還促進病毒復(fù)制引起持續(xù)的免疫反應(yīng)，促使HBV感染肝細胞引發(fā)慢性炎性反應(yīng)。

2 低表達lncRNAs

2.1lncRNA GAS5 GAS5全長約為651 bp，定位于染色體1q25.1，于1988年在生長阻滯細胞中被發(fā)現(xiàn)。GAS5的編碼基因是5′-末端寡嘧啶束(5′TOP)家族成員，包含12個外顯子，內(nèi)含子可編碼10個box C/D snoRNA。KINO等[19]發(fā)現(xiàn)成熟的lncRNA GAS5在一系列物種中的生長阻滯期積累，在缺乏血清或缺少生長因子誘導(dǎo)的生長抑制狀態(tài)下呈明顯上調(diào)趨勢。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在HBV陽性患者的血清中GAS5檢出率明顯高于健康人，GAS5可能通過以下幾種途徑參與HBV DNA的復(fù)制：mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶-相關(guān)激酶家族。這些激酶介導(dǎo)細胞對壓力的反應(yīng)，如DNA損傷和營養(yǎng)缺乏，該蛋白質(zhì)作為FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物細胞周期停滯和免疫抑制作用的靶標。LAPLANTE等[20]發(fā)現(xiàn)，5′TOP RNA GAS5通過影響雷帕霉素，減弱mTOR通路的特異性抑制細胞周期阻滯效應(yīng)。HBV DNA大量復(fù)制時，由于p53與HBV增強子的特定區(qū)域結(jié)合，p53調(diào)控5′TOP RNA GAS5的表達受到抑制，GAS5通過影響雷帕霉素，減弱GAS5對生長停滯的保護效應(yīng)，進一步促進HBV DNA的復(fù)制。

lncRNA GAS5具有細胞內(nèi)天然“分子海綿”的作用，GAS5作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)吸附miR-21，使mRNA-21表達上調(diào)進而發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能，影響HBV復(fù)制[21]。miR-123作用于HBV core mRNA，減少HBV核心蛋白表達量，下調(diào)HBV的復(fù)制[22]。GAS5啟動子區(qū)存在CpG島，啟動子的高度甲基化使轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，下調(diào)GAS5的表達，增強HBV DNA的復(fù)制，誘導(dǎo)HBV陽性者肝纖維化、肝細胞癌的發(fā)生，促使腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

2.2lncRNA MEG3 MEG3轉(zhuǎn)錄長度約為1.6 kb，定位于染色體14q32.3的DLK1-MEG3印跡區(qū)域。通過MEG3基因內(nèi)10個外顯子可剪接產(chǎn)生16種不同變體，現(xiàn)已證實有16種人MEG3 cDNA同種型。其中，變體1(NR_002766)即為MEG3，是主要的轉(zhuǎn)錄本[23-24]。有研究報道，MEG3可以通過依賴p53的方式調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[25-26]。P53蛋白共有3個主要的結(jié)構(gòu)域，N-末端反式激活結(jié)構(gòu)域(TAD)、中間序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和含寡聚化結(jié)構(gòu)域的C-末端調(diào)節(jié)區(qū)(OD)。MEG3可以與P53蛋白的DBD直接結(jié)合，以依賴p53的方式使P53蛋白在細胞內(nèi)積聚，延長P53蛋白半衰期,影響正常的細胞周期，還可通過抑制p53依賴的啟動子轉(zhuǎn)錄和選擇性地調(diào)節(jié)p53下游的靶基因GDF15的表達，使HBV DNA復(fù)制的負性調(diào)控作用減弱。MEG3也可以通過不依賴p53的方式，如通過募集一些蛋白復(fù)合體對p53下游靶基因發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用，干擾HBV DNA的復(fù)制。P53蛋白和HBV的結(jié)合方式有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合(P53蛋白與HBX Ag的結(jié)合),DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合(HBV DNA與P53蛋白的結(jié)合)，研究發(fā)現(xiàn)積聚的P53蛋白與HBX Ag可進一步反式激活、增強HBV的復(fù)制[27]。

研究發(fā)現(xiàn)，許多白細胞介素(IL)家族成員，如IL-6、IL-8，IL-24，和IL1A的表達量在MEG3穩(wěn)定高表達細胞中均顯著增加，炎癥因子IL-6在HBV感染早期可以通過調(diào)控HNF4a的表達來抑制HBV的復(fù)制，這也是炎癥因子調(diào)控HBV復(fù)制的重要手段[28]。隨著HBV復(fù)制，MEG表達量逐漸降低，IL家族抑制HBV復(fù)制的作用逐漸減弱，HBV利用宿主的特異性代謝活動來促進自身病毒的增殖。此外，基因的甲基化在細胞增殖、DNA修復(fù)、細胞周期調(diào)控和凋亡中起著重要作用[28]。MEG3的啟動子區(qū)富含CpG島，并且有兩個差異性的甲基化區(qū)域(DMRs)IG-DMR和MEG3-DMR，均位于MEG3基因的上游。ZHANG等[29]認為MEG3啟動子或基因間差異DMRs甲基化可能是導(dǎo)致細胞中MEG3低表達或表達缺失的主要原因，成為HBV復(fù)制失去抑制的又一重要原因。

3 其 他

除了如上所述眾多的lncRNAs，還有許多其他因素也間接參與HBV的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[30]。例如：雌激素可以通過雌激素受體(ER-a)抑制由HNF4a介導(dǎo)的病毒轉(zhuǎn)錄活性，進一步調(diào)控病毒基因表達和復(fù)制，這也能部分解釋在HBV感染人群中女性比男性的HBV載量要低的原因。干擾素是宿主細胞應(yīng)對病毒入侵的天然保護手段，HBV感染及復(fù)制時誘導(dǎo)的干擾素或者外源治療使用的干擾素都可誘導(dǎo)大量的抗病毒基因的表達。炎癥因子IL-6在HBV感染早期也可以通過調(diào)控HNF4a的表達來抑制HBV的復(fù)制。靶向干預(yù)HBX與肝細胞內(nèi)DDB1-E3泛素連接酶結(jié)合，阻斷HBX對smc5/6復(fù)合體等宿主限制因子的降解，增強對cccDNA的抑制作用，進一步影響HBV基因組的轉(zhuǎn)錄，干擾子代病毒的產(chǎn)生。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)血清中存在抗體所包裹的乙型肝炎亞病毒顆粒，以衣殼-抗體復(fù)合物的形式存在，為HBV RNA的主要載體，因其對抗病毒藥物的敏感性明顯低于HBV DNA，考慮將其作為肝內(nèi)cccDNA的替代標志物，為抗HBV治療后療效評估提供新的檢測指標[31]。

4 總結(jié)與展望

隨著對lncRNAs的關(guān)注，目前發(fā)現(xiàn)有多種lncRNAs廣泛參與HBV復(fù)制的各個階段，它們在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)頻繁異常表達。本文以現(xiàn)有的文獻為依據(jù)，總結(jié)了lncRNAs在HBV復(fù)制過程中周期調(diào)控、染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯調(diào)控、增強子/啟動子修飾、HBV嗜肝特性等方面內(nèi)容，明確了HBV與P53蛋白的關(guān)系，既存在DNA-蛋白質(zhì)(HBV DNA-P53蛋白)結(jié)合形式，也存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(HBXAg-P53蛋白)結(jié)合形式，詳細闡述了lncRNAs與HBV復(fù)制調(diào)控間的最新研究成果。進一步了解HBV復(fù)制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與lncRNAs之間的相互作用,為發(fā)現(xiàn)更好的抗HBV治療策略提供思路，為肝臟疾病的早期診斷和早期治療提供新的生物標志物以及準確的藥物作用靶點。