田海英 張東旸 徐榮建 秦毅 蘭亞良 矯文捷 韓玉棟

肺癌是發(fā)病率和死亡率高居第一位的惡性腫瘤，對(duì)人類(lèi)的身體健康構(gòu)成了極大的威脅，其中大部分是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]。肺癌的發(fā)生發(fā)展與基因表達(dá)及信號(hào)通路傳導(dǎo)異常密切相關(guān)，研究該過(guò)程中的具體分子機(jī)制是當(dāng)今NSCLC基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[2]。我們前期通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRIM59 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織。TRIM59已被報(bào)道與腦膠質(zhì)瘤[3]、胃癌[4]、膽管癌[5]、乳腺癌[6,7]、卵巢癌[8]等多種癌癥密切相關(guān)，但與NSCLC的關(guān)系尚不清楚。在該研究中，首先通過(guò)挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的NSCLC數(shù)據(jù)信息，分析TRIM59 mRNA在NSCLC中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系；進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)TRIM59蛋白在NSCLC中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC的診斷和治療提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 高通量芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus, GEO）和腫瘤基因組計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 本研究中通過(guò)檢索TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫(kù)中的NSCLC基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，用于基因差異分析和預(yù)后分析。

1.2 研究對(duì)象及臨床資料 收集2009年1月-2010年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)切除的90例患者的NSCLC組織和癌旁組織標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)：初診，術(shù)前未放化療，術(shù)后病理為NSCLC，圍術(shù)期未出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，所有病例的臨床資料、病理分型分期及隨訪(fǎng)信息完整，隨訪(fǎng)截止時(shí)間2018年12月。該研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者及家屬的知情同意。1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TRIM59蛋白在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

1.3.1 免疫組織化學(xué)試劑 一抗為T(mén)RIM59多克隆抗體（貨號(hào)：HPA017750，Sigma公司，美國(guó)），工作濃度是1:150；SP法免疫組化試劑盒：3% H2O2，封閉用正常血清工作液，生物素化通用二抗工作液，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（中杉金橋，中國(guó)）；DAB顯色試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）；蘇木素染料（中杉金橋，中國(guó)）。

1.3.2 免疫組織化學(xué)步驟 （1）脫蠟：玻片置于60oC烤箱中2.5 h；二甲苯脫蠟15 min，共2次；梯度酒精水化5 min，共4次；ddH2O中浸泡5 min。（2）抗原修復(fù)：玻片置于抗原修復(fù)液中，微波爐中高火加熱3 min（91oC-93oC），室溫靜置5 min（77oC-78oC），低火加熱24 min（80oC-90oC）。（3）去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：加3% H2O2，孵育5 min，PBS沖洗3 min，共3次。（4）封閉：滴加適量的Blocking Solution（BS），孵育10 min；吸棄BS，不沖洗。（5）一抗孵育：滴加適量的一抗（3% BSA-PBS稀釋?zhuān)?，Parafilm膜覆蓋后置于濕盒內(nèi)4oC過(guò)夜。（6）二抗孵育：玻片室溫孵育30 min，PBS清洗3 min，3次；滴加適量的生物素化通用二抗，室溫孵育15 min；PBS清洗3 min，3次；滴加適量的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育15 min；PBS清洗3 min，3次。（7）DAB染色：滴加適量的DAB稀釋液，染色，ddH2O終止反應(yīng)。（8）蘇木素復(fù)染：蘇木素染色6 s，清水漂洗，PBS內(nèi)反藍(lán)10 min。（9）脫水封片：梯度酒精5 min，4次，二甲苯5 min，2次，中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 免疫組織化學(xué)評(píng)定方法 由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行雙盲閱片。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分相加進(jìn)行半定量分析。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分（無(wú)細(xì)胞染色），1分（淺棕色顆粒），2分（棕黃色顆粒），3分（褐色顆粒）。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：0分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于10%），1分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)介于10%-25%），2分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)介于26%-50%），3分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在50%以上）。將兩項(xiàng)得分相加即為最后得分，分為兩組：0分-2分為陰性表達(dá)，3分-6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0軟件（Chicago, IL, USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 7（San Diego, CA, USA）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，采用Image J（National Institutes of Health）軟件分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示計(jì)量資料，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)，單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)和Cox回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM59 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)高于癌旁組織 前期利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRIM59 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（圖1A，P=0.000,5，配對(duì)t檢驗(yàn)）。通過(guò)挖掘GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證了此發(fā)現(xiàn)：GSE19804數(shù)據(jù)集包含60對(duì)NSCLC組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（圖1B，P＜0.000,1），GSE19188數(shù)據(jù)集包含91例肺癌組織和65例癌旁組織（圖1C，P＜0.000,1），TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)集包含513例肺腺癌組織和58例癌旁組織（圖1D，P＜0.000,1），TCGA肺鱗癌數(shù)據(jù)集包含502例肺鱗癌組織和51例癌旁組織（圖1E，P＜0.000,1），結(jié)果均顯示肺癌組織中TRIM59 mRNA的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期升高，TRIM59 mRNA的表達(dá)量也隨之升高（圖1F），上述結(jié)果說(shuō)明TRIM59與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

2.2 TRIM59 mRNA的表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 為了深入了解TRIM59的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系，我們分析了GSE31210和GSE30219數(shù)據(jù)集，以中位數(shù)作為cutoff值，根據(jù)TRIM59的表達(dá)量分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，不論是無(wú)復(fù)發(fā)生存期還是總生存期，TRIM59高表達(dá)的患者均低于TRIM59低表達(dá)患者（圖2A-圖2D）。同時(shí)我們也分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中NSCLC患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期和總生存期，得到了同樣的結(jié)果（圖2E、圖2F）。上述數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明TRIM59在NSCLC的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

2.3 TRIM59蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 利用免疫組化方法檢測(cè)TRIM59蛋白在90對(duì)NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM59在癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織低表達(dá)或不表達(dá)（圖3A），兩組之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3B，P＜0.000,1），其中有52例TRIM59呈陽(yáng)性表達(dá)，38例TRIM59呈陰性表達(dá)。TRIM59定位于胞漿或核，陽(yáng)性表達(dá)呈彌漫染色，淡黃至棕黃、棕褐色。我們分析了TRIM59的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TRIM59的表達(dá)與腫瘤大?。≒=0.007）、TNM分期（P=0.003）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.003）、分化程度（P=0.009）密切相關(guān)，與年齡、性別、病理類(lèi)型無(wú)關(guān)（表1）。

圖 1 TRIM59 mRNA在NSCLC組織和癌旁組織的表達(dá)。A-E：TRIM59 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（A：高通量測(cè)序數(shù)據(jù)；B：來(lái)自GSE19804數(shù)據(jù)集；C：來(lái)自GSE19188數(shù)據(jù)集；D：來(lái)自TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)集；E：來(lái)自TCGA肺鱗癌數(shù)據(jù)集）；F：隨著腫瘤分期的增高，TRIM59 mRNA的表達(dá)量有增高趨勢(shì)。Fig 1 The expression level of TRIM59 mRNA in tumor and normal adjacent tissues. A-E: The expression level of TRIM59 mRNA was higher in tumor tissues compared with adjacent tissues (A: Data from our hospital; B: Data from GSE19804; C: Data from GSE19188; D: Data from TCGA lung adenocarcinoma; E: Data from TCGA lung squamous cell carcinoma); F: The expression level of TRIM59 mRNA is higher in advanced stage. GEO: Gene Expression Omnibus; TCGA: The Cancer Genome Atlas. NSCLC: non-small cell lung cancer.

圖 2 TRIM59 mRNA高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)。A-B：GSE31210數(shù)據(jù)集患者的生存分析；C-D：GSE30219數(shù)據(jù)集患者的生存分析；E-F：TCGA數(shù)據(jù)集患者的生存分析。Fig 2 TRIM59 mRNA overexpression was associated with poor prognosis in NSCLC. A-B: Survival analysis of NSCLC patients from GSE31210 dataset; C-D: Survival analysis of NSCLC patients from GSE30219 dataset; E-F: Kaplan-Meier survival analysis of NSCLC patients from TCGA dataset.

2.4 TRIM59 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 進(jìn)一步分析TRIM59蛋白表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示TRIM59蛋白的表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)，TRIM59蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后較差（圖3C）。臨床工作中TNM分期是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的重要指標(biāo)，晚期肺癌患者的生存時(shí)間明顯短于早期肺癌患者（圖3D）。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示TNM分期（P＜0.001）和TRIM59（P=0.005）的表達(dá)可作為獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子來(lái)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后（表2）。

3 討論

圖 3 TRIM59蛋白高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)。A-B：肺癌組織及癌旁組織TRIM59蛋白的免疫組化結(jié)果（LUSC：肺鱗癌；LUAD: 肺腺癌）；C：我院90例NSCLC患者的生存分析（P=0.006,7）；D：不同TNM分期患者的生存分析。Fig 3 TRIM59 protein overexpression was associated with poor prognosis in NSCLC. A-B: Immunohistochemical staining of TRIM59 in tumor tissues and adjacent tissues; C: Kaplan-Meier survival analysis of NSCLC patients from our hospital (P=0.006,7); D: Kaplan-Meier survival analysis of NSCLC patients with different TNM stage. LUSC: lung squamous cell carcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma. TNM: tumor-nodemetastasis.

肺癌是全球發(fā)病和死亡率最高的惡性腫瘤之一，由于局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及耐藥等原因，每年因肺癌死亡的患者約占所有癌癥死亡患者總數(shù)的1/5，居癌癥之首[9]。現(xiàn)階段肺癌相關(guān)基因的研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，但迄今為止，肺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明。前期通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRIM（Tripartite motif）家族的多個(gè)基因（TRIM25、TRIM28、TRIM47、TRIM59、TRIM66等）在癌組織中表達(dá)顯著升高，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)TRIM47可能通過(guò)泛素化修飾降解P53和IκB，進(jìn)而參與P53和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factorκB, NF-κB）的調(diào)控，促進(jìn)NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。目前關(guān)于TRIM59在NSCLC中的表達(dá)情況及作用的研究較少。

TRIM家族蛋白是E3泛素連接酶的重要成員[11]，越來(lái)越多的研究證實(shí)TRIM家族成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控腫瘤相關(guān)分子的表達(dá)、化療耐藥等，這為研究TRIM家族蛋白在癌癥中的作用機(jī)制提供了科學(xué)的理論依據(jù)[12,13]。TRIM59蛋白是由TRIM59基因編碼的蛋白質(zhì)，是TRIM 亞家族C-XI的一員，因具有RING結(jié)構(gòu)域而有E3泛素連接酶活性，在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14,15]。國(guó)內(nèi)學(xué)者[4]研究發(fā)現(xiàn)TRIM59在胃癌組織中高表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TRIM59可以與P53結(jié)合，促進(jìn)了P53的泛素化降解，進(jìn)而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。其他學(xué)者[16,17]在骨肉瘤和宮頸癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)TRIM59作為重要的癌基因促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

表 1 TRIM59蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Correlation between TRIM59 protein expression and clinicopathological features of patients with NSCLC

表 2 NSCLC患者總生存期的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis for overall survival in NSCLC patients

隨著世界各國(guó)及科研單位對(duì)大數(shù)據(jù)的重視及財(cái)力物力的投入，建立了眾多由癌癥微陣列數(shù)據(jù)為主導(dǎo)的數(shù)據(jù)檢索平臺(tái)，包括TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)等。通過(guò)挖掘上述公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表了許多重量級(jí)的文章，得到了越來(lái)越多研究者的重視[18]。本研究中，我們首先從mRNA水平探討TRIM59在NSCLC中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。前期高通量測(cè)序結(jié)果顯示TRIM59 mRNA在NSCLC組織中表達(dá)升高，為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)GSE19804數(shù)據(jù)集、GSE19188數(shù)據(jù)集、TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)集和TCGA肺鱗癌數(shù)據(jù)集中肺癌組織TRIM59 mRNA的表達(dá)均高于癌旁組織，且隨著分期的增高，TRIM59 mRNA的表達(dá)量有增高的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)TRIM59 mRNA表達(dá)高的肺癌患者，無(wú)論是無(wú)復(fù)發(fā)生存期還是總生存期均低于TRIM59 mRNA表達(dá)低的肺癌患者。

接下來(lái)，我們從蛋白水平探討TRIM59在NSCLC中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)免疫組化方法分析了90例NSCLC患者的存檔病理切片，其中TRIM59蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者52例，陰性表達(dá)患者38例，陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存時(shí)間較陰性表達(dá)患者短。Cox多因素回歸分析證實(shí)TRIM59和TNM分期是預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述結(jié)果提示TRIM59可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，TRIM59的陽(yáng)性表達(dá)可作為預(yù)測(cè)預(yù)后的獨(dú)立因素，這為深入研究NSCLC的標(biāo)志物以及靶標(biāo)治療提供了一條新思路。但本研究?jī)H從mRNA和蛋白層面分析了TRIM59在NSCLC中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，TRIM59在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的具體作用及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。

Author contributions

Han YD and Jiao WJ conceived and designed the study. Tian HY and Zhang DY performed the experiments. Xu RJ, Qin Y and Lan YL analyzed the data. Han YD provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.