牛永濤，謝 林，席志鵬，鄧蓉蓉

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院研究生院，南京 230038 2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，南京 230038

椎間盤退行性變?yōu)橄卵吹闹匾蛑籟1］。非手術(shù)或手術(shù)治療均不能徹底治愈椎間盤退行性變，且有復(fù)發(fā)的可能[2-3］。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有體外擴(kuò)增及分化成正常組織的潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下可以向成骨、成軟骨、成脂及髓核細(xì)胞分化，且具有免疫原性低和免疫調(diào)節(jié)性的特點[4-7］，一直是組織修復(fù)研究的熱點。近年來，誘導(dǎo)MSCs向髓核分化，用于修復(fù)椎間盤退行性變備受關(guān)注，并且在體內(nèi)及體外實驗證實具有可行性[8-10］。本文回顧分析近年MSCs向髓核分化的相關(guān)研究，從常用髓核細(xì)胞鑒定表型及MSCs向髓核分化的誘導(dǎo)方式等方面展開分析，現(xiàn)綜述如下。

1 常用髓核細(xì)胞鑒定表型

目前無特異性細(xì)胞表型可以確定髓核細(xì)胞。Lee等[11］的研究顯示，Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）、蛋白多糖、SOX-9是髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共同具有的基因表型，鑒定髓核細(xì)胞主要參考這3種基因的表達(dá)差異。近年來，有學(xué)者試圖通過比較軟骨細(xì)胞與髓核細(xì)胞基因表達(dá)差異，尋找髓核細(xì)胞較為特異性的基因來區(qū)別兩者，用以鑒定髓核細(xì)胞。Liu等[12］從6例接受腰椎融合術(shù)治療的患者體內(nèi)取出椎間盤組織，并成功分離出正常髓核細(xì)胞并培養(yǎng)。KRT18和KRT19為人類脊索特異性標(biāo)志物，常作為鑒定髓核細(xì)胞的陽性標(biāo)志物[13-14］。KRT19可作為髓核細(xì)胞鑒定的特有基因用于描述髓核細(xì)胞的特征[15-16］。PAX1與FOXF1作為鑒定髓核細(xì)胞新的陽性表型在MSCs向髓核分化研究中廣泛應(yīng)用，PAX1參與胚胎期調(diào)節(jié)椎間盤生成，F(xiàn)OXF1與椎間盤細(xì)胞生長、增殖有關(guān)，SHH信號軸激活PAX1、FOXF1的基因表達(dá)[17］。在一項髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的比較研究中，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞中KRT18、KRT19、PAX1及FOXF1的含量遠(yuǎn)多于軟骨細(xì)胞[18］。

2 MSCs向髓核分化方式

2.1 生長因子

細(xì)胞的生長因子在組織工程中發(fā)揮著重要作用，通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌促進(jìn)MSCs向髓核分化。其中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族廣泛存在于組織細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用。TGF-β家族在修復(fù)椎間盤退行性變中發(fā)揮著重要作用，研究表明，TGF-β具有促進(jìn)MSCs向髓核分化的作用，修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤，延緩椎間盤退行性變進(jìn)程，降低髓核細(xì)胞的凋亡率[19］。Tao等[20］的實驗研究中，骨髓MSCs被包封于葡聚糖/明膠水凝膠中的控釋給藥系統(tǒng)，以TGF-β3納米粒為載體移植至發(fā)生退行性變的椎間盤，實驗結(jié)果表明，TGF-β3具有誘導(dǎo)MSCs向髓核分化的作用，可幫助修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）聯(lián)合TGF-β1可促進(jìn)MSCs增殖及糖胺聚糖（GAG）、蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9、KRT19的表達(dá)增加[21］。此外，胰島素樣生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子等都具有促進(jìn)MSCs分化的能力。椎間盤內(nèi)具有多種生長因子，這些生長因子參與細(xì)胞的增殖及分化，在椎間盤退行性變的修復(fù)中發(fā)揮重要作用，正是這些生長因子的存在，使得MSCs移植修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤成為可能。但是生長因子誘導(dǎo)MSCs向髓核分化修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤確切機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.2 共培養(yǎng)

MSCs與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)MSCs向髓核分化，有助于修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤。Ouyang等[22］將人MSCs及人髓核細(xì)胞按1∶1共培養(yǎng)后，COLⅡ、蛋白多糖及GAG的表達(dá)增加。Arkesteijn等[23］將MSCs與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)在海藻酸鈉微球中，GAG的表達(dá)增加，在髓核細(xì)胞附近觀察到蛋白多糖的沉積。Strassburg等[24］比較了MSCs分別與發(fā)生退行性變的髓核細(xì)胞及正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)，認(rèn)為與發(fā)生退行性變的髓核細(xì)胞共培養(yǎng)更利于MSCs向髓核分化，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9表達(dá)較正常髓核共培養(yǎng)顯著增加，同時增加了軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1（CDMP-1）、TGF-β1、胰島素樣生長因子1（IGF-1）和結(jié)締組織生長因子（CTGF）基因的表達(dá)。Lehmann等[25］把MSCs與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)升高并參與細(xì)胞間通信。MSCs與髓核細(xì)胞相互作用，促進(jìn)了MSCs的表達(dá)譜向髓核細(xì)胞基因型轉(zhuǎn)化，可能是髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子刺激了MSCs向髓核細(xì)胞的分化，同時，MSCs可能對發(fā)生退行性變的髓核細(xì)胞具有營養(yǎng)作用。

2.3 低氧

椎間盤內(nèi)是一個特殊的低氧環(huán)境，髓核細(xì)胞在特殊低氧環(huán)境下具有正常繁殖及更新的能力，有學(xué)者根據(jù)這一特性，在模擬的低氧環(huán)境下誘導(dǎo)MSCs向髓核分化。Hudson等[26］報道了MSCs在低氧（5%O2）和常氧下向髓核分化的實驗結(jié)果，低氧條件促進(jìn)MSCs向髓核分化，GAG及膠原蛋白表達(dá)增加。Stoyanov等[27］的研究顯示，在低氧條件及TGF-5作用下，COLⅡ、蛋白多糖、KRT19及GAG表達(dá)增加，認(rèn)為在低氧條件及TGF-5作用下更有利于MSCs向髓核分化。Feng等[28］在研究低氧和支架構(gòu)筑對兔MSCs向髓核分化的影響時發(fā)現(xiàn)，在低氧三維支架中，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及GAG表達(dá)增加，同時低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）增加，認(rèn)為MSCs低氧三維支架可用于椎間盤內(nèi)移植，修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤。Cui等[29］采用低氧聯(lián)合含有 TGF-β1的三維支架誘導(dǎo)MSCs向髓核分化，發(fā)現(xiàn)在低氧（2%O2）條件下，COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9和HIF-1α表達(dá)增加，認(rèn)為含TGF-β1的靜電紡絲納米纖維支架支持MSCs在低氧下向髓核分化，是髓核再生的一種較為合適的選擇。Ni等[30］在低氧誘導(dǎo)胚胎源性干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化的研究中發(fā)現(xiàn)，低氧可促進(jìn)MSCs增殖及向髓核分化，表現(xiàn)為髓核細(xì)胞標(biāo)志物COLⅡ、蛋白多糖、SOX-9及HIF-1α表達(dá)增加。體外低氧條件模擬了椎間盤的低氧環(huán)境，在低氧微環(huán)境中，MSCs可向髓核表型分化，并且HIF-1α表達(dá)增加，進(jìn)一步證明低氧環(huán)境促進(jìn)MSCs向髓核細(xì)胞分化的可行性。

2.4 三維支架

支架材料可以為MSCs提供三維的生長環(huán)境，避免了單層細(xì)胞培養(yǎng)的弊端，使細(xì)胞間形成適宜的空間分布和良好的聯(lián)系，提供特殊的生長和分化信號，維持細(xì)胞的定向分化并維持表型。Vaudreuil等[9］采用MSCs光聚合生物凝膠支架修復(fù)椎間盤退行性變，MRI示髓核的基質(zhì)改善，組織學(xué)檢查示 凝膠組細(xì)胞增多，椎間盤退行性變減輕。Thorpe等[31］將MSCs及水凝膠一起注射到退行性變的椎間盤，注射后水凝膠與周圍髓核組織結(jié)合，促進(jìn)了MSCs向髓核分化，可以恢復(fù)腰椎的力學(xué)功能。Smith等[32］將MSCs接種于三維互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的體外研究發(fā)現(xiàn)，蛋白多糖、COLⅡ和GAG表達(dá)增加。Naqvi等[33］比較藻酸鹽和殼聚糖水凝膠中骨髓MSCs向髓核分化差異，結(jié)果顯示，殼聚糖水凝膠可調(diào)節(jié)GAG和膠原的表達(dá)；與殼聚糖相比，海藻酸鈉能更好地支持MSCs中GAG和COLⅡ表達(dá)。陳春等[34］介紹了采用明膠微支架裝載MSCs移植治療犬退行性變椎間盤比單純MSCs移植療效更佳。三維支架可對MSCs起保護(hù)和支持作用，相當(dāng)于細(xì)胞外基質(zhì)，三維支架結(jié)構(gòu)可容納更多的細(xì)胞，使細(xì)胞有更多的接觸機(jī)會，增加了細(xì)胞間的信號傳遞。同時，利用三維支架作為載體，與MSCs一起注射移植，為微創(chuàng)治療椎間盤退行性變提供了方便。但如何讓三維支架具有良好的生物可降解性，并且在組織形成過程中逐步降解而不影響正常組織生長及功能，仍是目前亟待解決的問題。

2.5 其他

有學(xué)者給予MSCs一定的應(yīng)力，促進(jìn)MSCs向髓核分化。Gan等[35］發(fā)現(xiàn)，給予MSCs較低壓縮負(fù)荷（5%）時，MSCs向髓核分化被促進(jìn)，蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9及GAG表達(dá)增加。Luo等[36］模擬微重力誘導(dǎo)MSCs向髓核分化，結(jié)果顯示，微重力下蛋白多糖、COLⅡ、SOX-9的表達(dá)增加，MSCs向髓核分化得到促進(jìn)。Yan等[37］將不同濃度丹酚酸b聯(lián)合MSCs移植入新西蘭家兔椎間盤內(nèi)，發(fā)現(xiàn)8周后蛋白多糖、COLⅡ的表達(dá)增加，結(jié)果提示丹酚酸b（1～10 mg/L）聯(lián)合MSCs移植修復(fù)椎間盤退行性變較單純MSCs移植更有效。還有部分學(xué)者將MSCs應(yīng)用于臨床，如Henriksson等[38］將MSCs移植入4位志愿者退行性變的椎間盤中，發(fā)現(xiàn)COLⅡ及SOX-9表達(dá)增加，表明MSCs向髓核分化。

3 結(jié)語和展望

應(yīng)用組織工程修復(fù)退行性變椎間盤已成為目前研究熱點，各種方式誘導(dǎo)MSCs向髓核分化在一定程度上取得了效果。使退行性變的椎間盤再生是未來修復(fù)椎間盤退行性變的理想手段。但由于椎間盤特有的生物力學(xué)性能及生理環(huán)境，目前大部分研究尚停留在實驗階段，還不能應(yīng)用于臨床。另外，目前也沒有確切有效的鑒定髓核細(xì)胞的方法，不能形成統(tǒng)一有效的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，在髓核細(xì)胞鑒定方面尚有不足。由于大部分誘導(dǎo)MSCs向髓核分化的研究僅有縱向比較，少有橫向的各種誘導(dǎo)方式之間的比較，故各種誘導(dǎo)方式之間差別目前尚不清楚，亦沒有形成一套安全、有效、穩(wěn)定的誘導(dǎo)方案。后續(xù)研究可考慮對各種誘導(dǎo)方案通過體內(nèi)外實驗進(jìn)行橫向比較，總結(jié)篩選出一套安全、合理、有效的方案，通過臨床試驗取得臨床資料，再次總結(jié)優(yōu)化，最終在臨床推廣。