劉玉明，蔣定文，李珂嫻，陳 偉，侯登勇

（中國(guó)人民解放軍海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200433）

銀參膠囊具有增強(qiáng)免疫力的作用，以刺五加提取物、銀耳提取物等為主要成分。刺五加又名五加參，主治腰膝酸軟、體虛乏力，對(duì)于提高機(jī)體免疫力有重要作用［1］。銀耳為祖國(guó)醫(yī)學(xué)著名的滋補(bǔ)藥，具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津等功效，可提高機(jī)體免疫力［2-3］。目前，對(duì)刺五加、銀耳的毒性報(bào)道甚少［4-5］，其遺傳毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，對(duì)銀參膠囊的遺傳毒性進(jìn)行研究，為其臨床應(yīng)用提供參考，為銀參膠囊保健食品申報(bào)資料提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：健康ICR小鼠，體質(zhì)量25．0～29．8 g，75只（雌性25只，雄性50只）。南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)為SCXK（蘇）2008-0004號(hào)，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)為SYXK（蘇）2012-0037。所有動(dòng)物均給予滅菌鼠飼料和滅菌水，滅菌水自由取用。

儀器：37XB型倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；XDS-1B型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；AL204型電子天平（瑞士Mettler公司）；LD5-2A型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；DHG-9140A型烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）；Heracell 150i型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Electron公司）。

試藥：銀參膠囊（上海麥迪普生物有限公司，批號(hào)為Y12061331）；Ames試驗(yàn)菌株（美國(guó)Moltox公司）；瓊脂粉、氯化鈉、Giemsa染液、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽、甲醇、伊紅染液（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；1，8二羥蒽醌（Macklin公司，批號(hào)為C10062078）；疊氮鈉（浙江東陽(yáng)市凱明特種試劑有限公司，批號(hào)為200901001）；2-氨基芴（2-AF，J＆K Scientific Ltd．，批號(hào)為L(zhǎng)P50M40）；環(huán)磷酰胺（江蘇盛油醫(yī)藥有限公司，批號(hào)為12766768）；敵克松（AccuStandard，批號(hào)為4030165-01）。

1．2 方法

1．2．1 Ames試驗(yàn)

采用平板摻入法。將銀參膠囊設(shè)8，40，200，1 000，5 000μg／皿5個(gè)濃度，作為劑量組，無(wú)菌稱取500 mg樣品，精密稱定，加入滅菌純凈水，定容至10 mL，再用滅菌純凈水連續(xù)5倍稀釋成所需各濃度。設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組各1個(gè)，以及陽(yáng)性對(duì)照組4個(gè)，其中陽(yáng)性對(duì)照物分別為敵克松（Dexon）50μg（-S9）、疊氮鈉（NaN3）為1．5μg（-S9）、2-AF為10μg（＋S9），1，8-二羥基蒽醌為50μg（＋S9）。陽(yáng)性藥分別用蒸餾水和DMSO溶解，加藥體積均為0．1 mL。所選菌株為TA97，TA98，TA100，TA102［6-7］，經(jīng)基因型鑒定，符合要求后將各菌株過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)菌濃度均在109個(gè)／mL或以上。S9肝微粒體酶由Aroclor1254誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿，S9混合液中S9濃度為10%。每種菌株每個(gè)測(cè)試濃度做3皿平行，計(jì)數(shù)每個(gè)試驗(yàn)平皿生長(zhǎng)菌落數(shù)，試驗(yàn)共測(cè)試2次。

1．2．2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

將50只ICR小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為5組，分別為劑量組3個(gè)，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組各1個(gè)，各10只。銀參膠囊人體推薦劑量為1．05 g／d，即推薦劑量為17．5 mg／kg BW，3個(gè)劑量組分別按人體推薦劑量的143倍、286倍、572倍進(jìn)行設(shè)計(jì)，各劑量組配制方法如下。稱取銀參膠囊粉末2 500，5 000，10 000 mg，精密稱定，加純凈水至20 mL配制成受試物，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為低劑量組（2．5 g／kg BW）、中劑量組（5．0 g／kg BW）、高劑量組（10．0 g／kg BW）；陽(yáng)性對(duì)照組取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至20 mL，配制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL（環(huán)磷酰胺40 mg／kg BW），備用；空白對(duì)照組給予蒸餾水。各組均采用30 h灌胃法2次，每次灌胃容量為20 mL／kg。第2次灌胃后6 h取股骨骨髓懸于小牛血清中直接涂片、固定、染色，鏡檢嗜多染紅細(xì)胞（PCE）1 000個(gè)／鼠，計(jì)數(shù)含微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞微核率。對(duì)每只動(dòng)物觀察并記錄200個(gè)PCE及所見(jiàn)成熟紅細(xì)胞（NCE），依此計(jì)算PCE／NCE比值［8］。

1．2．3 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)

將25只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為5組，劑量組3個(gè)、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組各1個(gè)，各5只。3個(gè)劑量組配制方法同1．2．2。陽(yáng)性對(duì)照組取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為4 mg／mL，備用；空白對(duì)照組給予蒸餾水。各劑量組和空白對(duì)照組均連續(xù)灌胃5 d，每次灌胃容量均為20 mL／kg，每天1次；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射（環(huán)磷酰胺40 mg／kg BW），連續(xù)5 d，每天1次，劑量為10 mg／kg。各組動(dòng)物均于處死前6 h腹腔注射秋水仙素4 mg／kg，第14天殺鼠取睪丸，拉開(kāi)曲細(xì)精管，低滲、固定、軟化、制片、染色、鏡檢。對(duì)每只動(dòng)物完成500個(gè)完整精子的鏡檢，計(jì)算畸形率［9］。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。采用χ2檢驗(yàn)法和二項(xiàng)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Ames試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1。與未處理對(duì)照組菌落數(shù)相比，陽(yáng)性對(duì)照組有顯著差異（P＜0．01），各試驗(yàn)組均未超過(guò)2倍以上，樣品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌TA97，TA98，TA100，TA102均未檢出明顯的誘變活性，結(jié)果為陰性，故認(rèn)為銀參膠囊無(wú)致突變性。

2．2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表2。各劑量組的微核率與空白對(duì)照組相比，均無(wú)顯著差異（P＞0．05），也無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，陽(yáng)性對(duì)照組微核率與空白對(duì)照組相比，有顯著差異（P＜0．01）；各劑量組PCE／NCE比值均不低于對(duì)照組的20%，顯示受試物對(duì)紅細(xì)胞無(wú)抑制作用。銀參膠囊未顯示使小鼠骨髓PCE細(xì)胞微核率上升的致突變作用，在受試劑量下，未檢出銀參膠囊樣品對(duì)雄性小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞致微核作用。

2．3 睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)

結(jié)果見(jiàn)表3。樣品各劑量組小鼠具染色體畸變的初級(jí)精母細(xì)胞率較空白對(duì)照組均無(wú)顯著差異（P＞0．05），也無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，陽(yáng)性對(duì)照組較空白對(duì)照組有顯著差異（P＜0．01）。在受試劑量下，未檢出該樣品對(duì)雄性小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體的誘變活性。

表1 銀參膠囊Ames試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3，第1次／第2次）

注：a為Dexon（50μg／皿），b為NaN3（1．5μg／皿），c為2-AF（10．0μg／皿），d為1，8-二羥基蒽醌（50μg／皿）；與溶劑對(duì)照組比較，*P＜0．01。

組別劑量（μg／皿）TA97 TA98 TA100 TA102空白對(duì)照組溶劑對(duì)照組銀參膠囊組0 141±15／121±19 0 130±13／144±18 8136±16／153±12 40125±13／168±16 200129±15／162±14 1 000 5 000陽(yáng)性對(duì)照組-S9 132±14／137±15 112±15／113±17 1 232±214c*／1 195±18 5 c*＋S9 127±17／117±14 112±14／122±15 122±16／116±14 121±16／161±15 116±16／140±15 125±13／132±16 106±14／100±16 1 416±190a*／1 3 29±198 a*-S9 31±3／35±5 35±5／42±4 36±3／39±6 34±4／36±4 37±3／35±5 36±4／44±3 33±2／43±3 1 376±153c*／1 230±200c*＋S9 30±2／31±2 32±2／30±2 31±2／30±4 29±3／33±3 32±4／33±4 29±3／34±2 32±3／37±3 1 208±195a*／1 366±211 a*-S9 142±15／129±16 146±18／122±14 178±15／132±16 164±18／139±17 158±17／163±17 186±18／156±15 177±17／165±19 1 185±184c*／1 080±143 c*＋S9 129±16／142±15 122±14／145±16 128±16／124±15 117±16／119±16 120±14／108±15 128±17／128±17 119±15／121±16 1 510±211b*／1 476±165b*-S9 269±26／255±21 262±21／257±21 258±27／252±27 251±23／257±28 272±21／264±21 266±28／251±26 255±33／258±24 835±64 d*／799±129d*＋S9 249±24／250±22 255±20／247±25 251±22／248±23 245±25／252±22 253±20／259±28 248±20／246±22 241±28／255±21 1 214±179a*／1 124±17 4a**

表2 銀參膠囊小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果（X±s，雌性／雄性，n＝5）

表3 銀參膠囊小鼠睪丸染色體試驗(yàn)結(jié)果［個(gè)（X±s，%），n＝5］

3 討論

遺傳毒性研究是藥物安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，是藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié)，遺傳毒性研究在很大程度上將影響到藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)程［10］。

Ames試驗(yàn)為體外試驗(yàn)，是當(dāng)前所有遺傳毒性評(píng)價(jià)方法中對(duì)致癌物預(yù)測(cè)度最高的試驗(yàn)，其遺傳學(xué)終點(diǎn)是基因突變，是通過(guò)能否引起鼠傷寒沙門菌基因組堿基置換或移碼型突變來(lái)評(píng)價(jià)藥物的，是化合物定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫(kù)的重要基礎(chǔ)［11］。本研究結(jié)果顯示，銀參膠囊對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型4個(gè)菌株TA97，TA98，TA100，TA102均無(wú)致突變作用。小鼠骨髓PCE微核試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)外源性因素對(duì)人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)直觀、有效、可行的方法［12］。由于其能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑，故廣泛應(yīng)用于化合物遺傳毒性篩選及評(píng)價(jià)［13-14］。銀參膠囊的微核試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠骨髓PCE的微核率有明顯影響，可認(rèn)為該試驗(yàn)為陰性。小鼠睪丸細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)食品、藥品等對(duì)雄性小鼠生殖功能產(chǎn)生的影響，其機(jī)制主要是觀察睪丸細(xì)胞染色體的形態(tài)改變［15］。試驗(yàn)中亦未發(fā)現(xiàn)銀參膠囊對(duì)小鼠睪丸染色體畸形發(fā)生率有明顯影響。

綜上所述，銀參膠囊3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，判定其遺傳毒性安全。今后應(yīng)開(kāi)展多項(xiàng)研究，為開(kāi)發(fā)更多新的功能提供科學(xué)依據(jù)，也為長(zhǎng)期作業(yè)在特殊環(huán)境中的廣大官兵健康維護(hù)提供新的產(chǎn)品。

致謝：特別感謝江蘇省疾控中心毒理與功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的各位老師對(duì)本研究中試驗(yàn)方案給予的指導(dǎo)及在試驗(yàn)操作中所付出的努力。