唐保明，李釗偉，楊?lèi)?ài)榮，王卓亞

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）被認(rèn)為是大手術(shù)的常見(jiàn)并發(fā)癥，特征是術(shù)后短期或／和長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行能力等神經(jīng)心理測(cè)試成績(jī)較術(shù)前水平有所下降［1］。POCD與住院時(shí)間延長(zhǎng)、日常功能受損和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加等不良結(jié)局有關(guān)［2］。手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎性反應(yīng)過(guò)程在POCD的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，術(shù)后記憶缺失與血漿和海馬組織中細(xì)胞因子水平的升高是平行的，而阻斷炎性反應(yīng)過(guò)程可減輕記憶功能障礙［3-4］。在正常的靜息狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)能分泌低水平的促炎細(xì)胞因子［如白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等］，積極調(diào)節(jié)神經(jīng)回路的重構(gòu)，促進(jìn)記憶鞏固和神經(jīng)發(fā)生。但這些促炎細(xì)胞因子過(guò)量生產(chǎn)會(huì)引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，對(duì)記憶和神經(jīng)產(chǎn)生直接的有害影響，最終導(dǎo)致POCD［5］。大麻素2型受體（CB2R）主要存在于外周免疫系統(tǒng)，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥時(shí)，腦內(nèi)CB2R表達(dá)顯著上調(diào)［6］。CB2R在神經(jīng)系統(tǒng)中的保護(hù)作用已在動(dòng)物模型中得到證實(shí)，特別是在阿爾茨海默病和中風(fēng)的動(dòng)物模型中［7］。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，具有抗氧化損傷、清除自由基和提高記憶力等作用［8］。本研究中通過(guò)制備大鼠脛骨骨折模型，給予紅景天苷進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察大鼠認(rèn)知功能改善情況，并探討其潛在機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇18～20個(gè)月齡健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量450～500 g，購(gòu)自中南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2008-0004，動(dòng)物合格證編號(hào)為2007000577866。大鼠在SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均按照國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

試藥：紅景天苷（西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，純度＞95%）；異氟醚（魯南貝特制藥有限公司）；10%水合氯醛（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司）；IL-6，TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；鼠抗CB2R及CD11b單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

儀器：HBS-1096B型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Primo R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；BD垂直電泳儀（美國(guó)BD公司）；EC 300型凝膠成像儀（美國(guó)UVP公司）；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備（德國(guó)Leica公司）。

1．2 方法

1．2．1 分組及造模

將大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、POCD組和紅景天苷組，各20只。所有大鼠均用3．0%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，切開(kāi)膝關(guān)節(jié)下皮膚，顯露脛骨，將0．3 mm針插入其髓腔內(nèi)，進(jìn)行固定。除對(duì)照組外，其他組大鼠在脛骨中點(diǎn)處截?cái)喙穷^。用無(wú)菌生理鹽水清洗傷口，縫合。待大鼠蘇醒后回籠。大鼠蘇醒后，紅景天苷組給予75 mg／kg紅景天苷灌胃，對(duì)照組和POCD組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)到術(shù)后第7天。

1．2．2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

每組選10只大鼠，于術(shù)前1 d和術(shù)后1，7 d分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠自發(fā)活動(dòng)能力。保持九宮格曠場(chǎng)箱處于弱光、安靜環(huán)境，將大鼠放入曠場(chǎng)箱中央，任其自由行動(dòng)，采集大鼠5 min內(nèi)活動(dòng)軌跡，用SuperMaze高通量動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)分析軟件計(jì)算觀(guān)測(cè)時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離。

1．2．3 恐懼實(shí)驗(yàn)

每組選10只大鼠，于術(shù)前1 d進(jìn)行恐懼條件反射訓(xùn)練。將大鼠放入實(shí)驗(yàn)箱中接受聲音和足底刺激，以建立長(zhǎng)期記憶。于術(shù)后1，7 d分別進(jìn)行恐懼條件反射測(cè)試，記錄5 min內(nèi)大鼠僵直時(shí)間，用DigBehv動(dòng)物行為分析系統(tǒng)記錄僵直時(shí)間百分比。

1．2．4 檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定

血清中IL-6，TNF-α，MCP-1含量：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行心臟取血，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)含量，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

海馬組織中CB2R含量：大鼠處死后分離海馬組織，-80℃保存?zhèn)溆?。海馬組織（每組10只）用PIPA裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中總蛋白濃度。用100℃沸水對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)變性電泳，每孔上樣30μg，將印跡到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，加入鼠抗CB2R抗體（1∶1 000）和GADPH抗體（1∶10 000），4℃過(guò)夜，沖洗后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育30 min。用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯色，采集圖像，用圖像分析軟件（AlphaEaseFC軟件）分析。

海馬組織中CD11b含量：海馬組織（每組10只）用福爾馬林固定，脫水，包埋，將蠟塊切成3μm厚切片，用5%牛血清白蛋白封閉20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，4℃下用鼠抗CD11b單克隆抗體（1∶2 000）孵育過(guò)夜。沖洗后，切片用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶50）在室溫下黑暗中孵育2 h，洗滌后用熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)對(duì)免疫染色切片進(jìn)行觀(guān)察。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s），行單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)探索總路程

3組各時(shí)點(diǎn)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)探索總路程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。詳見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)探索總路程比較（X±s，cm，n＝10）

2．2 恐懼測(cè)試僵直時(shí)間

與對(duì)照組相比，POCD組和紅景天苷組術(shù)后1 d場(chǎng)景恐懼測(cè)試僵直時(shí)間百分比降低（P＜0．05）；與POCD組相比，紅景天苷組術(shù)后7 d場(chǎng)景恐懼測(cè)試僵直時(shí)間百分比升高（P＜0．05）；3組各時(shí)點(diǎn)聲音恐懼測(cè)試僵直時(shí)間百分比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。詳見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)恐懼測(cè)試僵直時(shí)間比較（X±s，%，n＝10）

2．3 各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)

與對(duì)照組相比，POCD組和紅景天苷組不同時(shí)點(diǎn)血清中IL-6，TNF-α，MCP-1，以及海馬組織中CB2R和CD11b含量均增加（P＜0．05）；與POCD組相比，紅景天苷組各檢測(cè)指標(biāo)含量均降低（P＜0．05）。詳見(jiàn)表3及圖1至圖3。

圖1 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬組織中CB2R含量比較

3 討論

神經(jīng)炎性與認(rèn)知障礙的相關(guān)性在POCD的機(jī)制中尤為突出［9］。細(xì)胞因子IL-6和TNF-α被認(rèn)為是與認(rèn)知障礙相關(guān)的神經(jīng)炎性介質(zhì)［10］。最新研究表明，POCD小鼠MCP-1 mRNA表達(dá)增加［11］。本研究中觀(guān)察到術(shù)后大鼠血清中IL-6，TNF-α，MCP-1含量增加導(dǎo)致記憶障礙。有研究顯示，術(shù)后使用CB2R抑制劑JWH133可改善術(shù)后記憶喪失，減輕海馬和前額葉皮質(zhì)炎性因子水平升高，提示抑制CB2R可能對(duì)術(shù)后早期認(rèn)知具有保護(hù)作用［12］。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，CB2R的上調(diào)是針對(duì)人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同類(lèi)型慢性損傷的常見(jiàn)反應(yīng)，且小膠質(zhì)細(xì)胞中CB2R的選擇性存在，強(qiáng)烈表明該受體在疾病相關(guān)的神經(jīng)炎性過(guò)程中的重要作用［13］。CD11b是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，對(duì)阿爾茨海默病的研究表明，CB2R通過(guò)抑制CD11b的活化減輕中樞炎性反應(yīng)［14］。本研究結(jié)果顯示，海馬依賴(lài)的認(rèn)知功能在術(shù)后受損，神經(jīng)炎性反應(yīng)增強(qiáng)。因海馬依賴(lài)的學(xué)習(xí)和記憶極易受炎癥影響，只有當(dāng)特定的潛在神經(jīng)內(nèi)通路，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）介導(dǎo)的通路受到顯著影響時(shí)，特定認(rèn)知區(qū)域的功能障礙才會(huì)發(fā)生［15］?？梢酝茰y(cè)，神經(jīng)炎性反應(yīng)可能啟動(dòng)了CB2R的上調(diào)，從而促進(jìn)了神經(jīng)炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，CB2R的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生介導(dǎo)。

表3 3組大鼠不同時(shí)點(diǎn)各檢測(cè)指標(biāo)含量比較（X±s，n＝10）

圖2 3組大鼠術(shù)后1 d海馬組織中CD11b含量比較（免疫熒光染色，×200）

圖3 3組大鼠術(shù)后7 d海馬組織中CD11b含量比較（免疫熒光染色，×200）

綜上所述，術(shù)后早期抑制CB2R對(duì)記憶有潛在保護(hù)作用。術(shù)后用紅景天苷治療可抑制神經(jīng)炎性，增強(qiáng)記憶。