張長(zhǎng)麗 徐 鑒 黃 芳 趙海榮 陳昌云

(南京曉莊學(xué)院環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新型功能材料南京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211171)

過(guò)渡金屬在生命體系中是一個(gè)矛盾的存在，一方面這些金屬在許多蛋白質(zhì)中擔(dān)任必需的輔因子，另一方面游離的或者水合形式的過(guò)渡金屬具有一定毒性。 Zn2+是許多參與水解和基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)酶中的一種輔因子[1]，也為蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)錄因子)提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[2-3]，并被認(rèn)為是神經(jīng)傳遞中的一種信號(hào)分子。然而，不穩(wěn)定的Zn2+會(huì)干擾許多生物過(guò)程，如缺血或癲癇發(fā)作后以及頭部損傷后鋅穩(wěn)態(tài)被破壞， 不穩(wěn)定的Zn2+增加從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷[4-6]，由鋅攝入不足是導(dǎo)致腸肢端皮炎重要原因[7]，因此在生命體系中Zn2+被要求維持在低游離濃度[8-9]。 為了更好地了解鋅在生物系統(tǒng)中的作用， 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中不穩(wěn)定鋅的分布和濃度是非常重要的。

光致發(fā)光技術(shù)以其高靈敏度、高選擇性、高時(shí)空分辨率被認(rèn)為是檢測(cè)Zn2+最有效的手段之一。 在過(guò)去的幾十年中， 人們報(bào)道了大量具有不同特性的光致發(fā)光Zn2+探針[10-16]。 尤其是比例計(jì)量型探針，可以避免光散射和探針濃度引起的偽影， 達(dá)到定量檢測(cè)活體樣本中Zn2+目的。 廣泛應(yīng)用于構(gòu)建比例計(jì)量探針的機(jī)理有光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移(PCT)[17-25]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[26-35]、金屬離子配位抑制激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)[36-43]、熒光團(tuán)互變異構(gòu)[44-45]和雙熒光團(tuán)方法[46-48]等。

除了上述一些機(jī)理以外， 利用Zn2+配位誘導(dǎo)芳環(huán)共面化引起分子熒光光譜的改變這一特性[49]設(shè)計(jì)Zn2+比例計(jì)量型熒光探針。 基于此機(jī)理，Ajayaghosh等構(gòu)建了含5，5′-二乙烯基-2，2′-聯(lián)吡啶衍生物的比例Zn2+探針， 該探針與Zn2+配位后，Zn2+誘導(dǎo)的芳香共平面增加了熒光分子的共軛， 導(dǎo)致發(fā)射波長(zhǎng)紅移[50]。 該小組后來(lái)又設(shè)計(jì)多個(gè)Zn2+探針，進(jìn)一步證明了這一結(jié)論[51-53]。 然而，基于這一機(jī)制構(gòu)造的比例計(jì)量型探針很少[54-56]。我們課題組基于此機(jī)理設(shè)計(jì)Zn2+熒光探針PBITA，其分子模型研究表明，Zn2+誘導(dǎo)的PBITA 的紅光發(fā)射位移可能與2-PBI 的2 個(gè)異芳族平面的共面有關(guān)[57]。 雖然PBITA 的發(fā)射在與Zn2+結(jié)合后呈現(xiàn)38 nm 的紅移， 但Zn2+誘導(dǎo)的熒光增強(qiáng)完全覆蓋了自由PBITA 的發(fā)射。 因此，PBITA 更被認(rèn)為是一個(gè)增強(qiáng)型的Zn2+探針。 為了進(jìn)一步證實(shí)該機(jī)理，將探針PBITA 進(jìn)行修飾，研制了新的Zn2+探針DBITA。在DBITA 中，在PBI 的5-位修飾供電子基N，N-二甲基， 通過(guò)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移促進(jìn)探針的ICT(intramolecular charge transfer，ICT)效 應(yīng)，一 方 面 使新Zn2+/探針配合物發(fā)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅移，探針在與Zn2+結(jié)合前后顯示出2 個(gè)發(fā)射帶， 并成為一個(gè)真正的比例計(jì)量型Zn2+探針；另一方面，提高探針本身的發(fā)光效率，有利于DBITA 在生物體系中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

KNO3，Zn(NO3)2，HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid),EGTA(ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)，2，6-二羥甲基吡啶和5-氯-2-硝基苯胺購(gòu)自Alfa 公司。 常用藥品(如鄰苯二胺，三乙胺，對(duì)甲基苯磺酰氯，酸堿，常規(guī)溶劑如甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等)均為市售國(guó)產(chǎn)試劑，使用前未做進(jìn)一步純化。 乙腈分別經(jīng)P2O5回流，無(wú)水K2CO3干燥，CaH2回流蒸出后使用。 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷和二甲基亞砜(DMSO)經(jīng)CaH2干燥后減壓蒸出使用。 四氫呋喃(THF)經(jīng)鈉/二苯甲酮回流蒸出后使用。 二(2-甲基吡啶基)胺(BPA)參照文獻(xiàn)方法合成[58]。 光譜性質(zhì)測(cè)試中， 所用溶劑如DMSO 等為光譜純?cè)噭?購(gòu)自Aldrich 公司， 水為MILIPORE 處理過(guò)的超純水。 電噴霧質(zhì)譜用LCQ 電噴霧質(zhì)譜儀(ESMS，F(xiàn)innigan)測(cè)定，并用ISOPRO 3.0程序模擬其同位素分布模式。1H，13C NMR 在Bruker DRX-500 或Bruker DRX-300 核磁儀上用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列測(cè)定(298 K)。 紫外光譜在Perkin-Elmer Lambda 35 紫外可見(jiàn)光譜儀上測(cè)定。 熒光光譜在AMINCO Bowman series 2 發(fā)光光譜儀上測(cè)定。 pH值用PHS-3 精密pH 計(jì)記錄。 紫外和熒光光譜數(shù)據(jù)用Origin 軟件包處理。

1.2 DBITA 的合成

Scheme 1 DBITA 合成線路圖Scheme 1 Synthesis of DBITA

化合物Ⅰ(4-N，N-二甲氨基-鄰苯二胺)和Ⅱ(二(2-吡啶甲基)(6-醛基-2-吡啶甲基)胺)根據(jù)文獻(xiàn)方法合成[59-60]。DBITA 合成路線[61]見(jiàn)Scheme 1。在裝有攪拌磁子、 恒壓滴液漏斗和回流冷凝管的100 mL 三頸燒瓶中加入新制的化合物Ⅰ(0.070 mg 0.46 mmol)、NaHSO3(0.053 g，0.51 mmol)和乙醇(5 mL)。 加熱至回流， 用恒壓滴液漏斗緩慢向反應(yīng)液中滴加化合物Ⅱ(0.156 mg，0.46 mmol) 的乙醇溶液10 mL，20 min 滴加完畢。 保持回流反應(yīng)12 h 后停止。 減壓蒸餾去除溶劑，將所得油狀物用CH2Cl2和水溶解，分出有機(jī)相， 飽和NaHCO3溶液和飽和食鹽水洗滌， 無(wú)水MgSO4干燥，濾除干燥劑，減壓蒸餾去除溶劑，柱層析分離(中性氧化鋁，CH2Cl2～CH2Cl2/MeOH(200∶1，V/V))得產(chǎn)品0.054 g，收率26%。 棕黃色油狀物，Rf=0.3(VEtOAc∶VMeOH=20∶1)。1H NMR (500 MHz，CDCl3)：δ 3.04(s，6H，-N(CH3)2)，3.91(s，2H，-CH2)，4.03(s，4H，-CH2)，6.93(s，1H，BI-H)，7.23(t，2H，J=6.0，Py-H)，7.29(d，2H,J=7.5，Py-H)，7.66～7.78(m，6H,BI-H and Py-H),8.20(d,1H，J=7.5，BI-H)，8.65 (d，2H，J=4.5，Py-H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ 41.56，58.23，59.90,93.99,111.16,118.95，119.22，119.79，122.17,122.99,123.43,135.77，136.52，137.17，148.09，148.57,148.74,149.69,156.93，158.98。MALDI-TOF(m/z)：Calcd. 450.23,Found:450.4 for [M+H]+。 Element analysis(%) Calcd. for C27H27N7：C，72.14；H，6.05；N，21.81。 Found：C，72.89；H，6.54；N，21.03。

1.3 DBITA 的光譜性質(zhì)測(cè)試

DBITA 用 光 譜 純DMSO 配 成1.18 mmol·L-1。取DBITA 的DMSO 儲(chǔ)備液加入到100 mL 的容量瓶中并用HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.2) 和DMSO 定容， 配成濃度為10 μmol·L-1的(VDMSO∶VHEPES=1∶99)溶液，然后分別進(jìn)行紫外以及熒光光譜的測(cè)量。

DBITA 的Zn2+紫外和熒光滴定實(shí)驗(yàn)在DMSOH2O(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)體系中進(jìn)行，紫外滴定參比溶液為空白的DMSO-H2O 溶液。 向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的配體溶液中分別加入不同體積的Zn(NO3)2水溶液(1.2 mmol·L-1)，每次加25 μL，充分混勻后進(jìn)行紫外和熒光測(cè)試。

1.4 金屬離子選擇性實(shí)驗(yàn)

金屬離子選擇性及Zn2+與堿金屬、 堿土金屬的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)都在上述DMSO-H2O 體系中進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)中，向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的溶液中加入25 μL 濃度為1.2 mmol·L-1的金屬離子水溶液，使金屬離子濃度與DBITA 濃度相等， 充分混勻后進(jìn)行測(cè)試。 競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)中，向3 mL DBITA(10 μmol·L-1)的溶液中加入25 μL 濃度為1.2 mol·L-1的Zn(NO3)2水溶液，充分混勻后記錄光譜。然后再向此溶液中分別加30 μL 濃度為1.0 mol·L-1的堿金屬或堿土金屬離子水溶液， 使溶液中堿金屬或堿土金屬的量達(dá)到10 mmol·L-1，即Zn2+濃度的1 000 倍，充分混勻后再次記錄光譜。

1.5 DBITA 對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)Zn2+的造影研究

造影實(shí)驗(yàn)中所用HeLa 細(xì)胞在含有10%胚胎小 牛 血清(FBS，Invitrogen)，青 霉 素(100 units·mL-1)和鏈霉素(100 mg·mL-1)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)中，37 ℃，5%(V/V) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 為了便于成像，HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃底的培養(yǎng)皿中。當(dāng)去掉介質(zhì)后，細(xì)胞用不含金屬的PBS 溶液(10 mmol·L-1)洗滌3 次，加入10 μmol·L-1DBITA 溶液在室溫下孵育20 min；吸掉溶液，再用PBS 溶液洗滌3 次， 然后用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。 細(xì)胞外源鋅的引入通過(guò)在Zn(NO3)2/巰基吡啶硫酮(pyrithone(2-mercaptopyidine-N-oxide))的1∶1 的PBS 溶液(5 μmol·L-1)中孵育10 min，用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行造影。 造影完畢后， 細(xì)胞再用0.05 mmol·L-1TPEN(由TPEN 的濃儲(chǔ)液通過(guò)PBS 稀釋得到)處理20 min 后，再用PBS 洗滌一次后造影。

成像在Olympus FV10-ASW 激光共聚焦熒光顯微鏡上完成。 激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，觀察波長(zhǎng)在500～540 nm 和580～620 nm 之間。

2 結(jié)果與討論

2.1 DBITA 的光譜性質(zhì)

為了便于比較， 將PBITA 與DBITA 光譜數(shù)據(jù)列于表S1。 紫外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與PBITA 相比，由于在PBI 的5 位引入供電子基團(tuán)N，N-二甲基，使DBITA 的最大吸收峰紅移到340 nm (ε=1.3×104L·mol-1·cm-1)，最大吸收峰歸屬于DBITA 中苯并咪唑部分π-π*躍遷引起的。 熒光光譜中(圖S1)，DBITA在水溶液中的熒光較強(qiáng)，熒光強(qiáng)度大約是PBITA 的3.5 倍，量子產(chǎn)率為0.18。 其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為362 和534 nm， 與PBITA 相比分別紅移了約26 和149 nm。與PBITA 類(lèi)似，在DBITA 的激發(fā)以及發(fā)射光譜中除了最大激發(fā)和發(fā)射峰外，在392 和493 nm處還同時(shí)存在一個(gè)激發(fā)和發(fā)射峰。以上結(jié)果表明，具有供電子作用的N，N-二甲基的引入，使DBITA 的紫外及發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，量子產(chǎn)率大幅度提高，達(dá)到了預(yù)期的設(shè)計(jì)目的。

2.2 DBITA 熒光對(duì)pH 的依賴性

由于生命體內(nèi)pH 值不會(huì)偏離中性太多， 因此發(fā)射光譜在近中性條件下不隨pH 變化是Zn2+熒光探針能夠在生命體系的應(yīng)用必要條件之一。 檢測(cè)了pH 值對(duì)DBITA 熒光發(fā)射譜的影響。 實(shí)驗(yàn)在含5 μmol·L-1DBITA 的DMSO/H2O(1∶99，V/V)溶液中進(jìn)行，溶液pH 值用5 mol·L-1的HNO3及5 mol·L-1的NaOH 水溶液調(diào)節(jié)。

如圖S2 所示，PBITA 的熒光發(fā)射光譜受pH 的影響較大。而DBITA 中5 位N 原子、吡啶以及苯并咪唑的N 原子在酸性條件下都容易發(fā)生質(zhì)子化，減弱了分子的ICT 效應(yīng)， 所以DBITA 的熒光發(fā)射強(qiáng)度在pH 2～6 的范圍內(nèi)隨酸性的增強(qiáng)熒光強(qiáng)度逐漸減弱， 并且在pH 2～3 時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生一定的紅移。 在pH 6～10 的范圍內(nèi)DBITA 的熒光強(qiáng)度受pH變化較小，都體現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光。這說(shuō)明螯合團(tuán)與熒光團(tuán)之間的PET 效應(yīng)很弱， 即使BPA 單元中的N原子質(zhì)子化以后也不會(huì)使探針的熒光有明顯增強(qiáng)，這與N，N-二甲基的推電子效應(yīng)密切相關(guān)。 隨pH 增大到10 以上，探針的熒光強(qiáng)度有所減弱，這可能是由于咪唑脫質(zhì)子后使5 位的N，N-二甲基到咪唑以及吡啶的推拉電子效應(yīng)(ICT 效應(yīng))減弱導(dǎo)致的。結(jié)果表明，DBITA 則在近中性條件下熒光強(qiáng)度較為穩(wěn)定，具有適合應(yīng)用于生命體內(nèi)造影的潛力。

2.3 DBITA 與Zn2+的熒光響應(yīng)行為

在HEPES 溶液中的Zn2+熒光滴定表明(圖1a)，隨著Zn2+的加入，DBITA 在493 和534 nm 處的發(fā)射峰逐漸降低，同時(shí)在609 nm 處出現(xiàn)一個(gè)新的發(fā)射峰，并且熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)c(Zn2+)total/c(DBITA)的值達(dá)到1 后，2 個(gè)發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度不再發(fā)生改變，這說(shuō)明Zn2+與DBITA 的方式結(jié)合為1∶1 結(jié)合。 用609和534 nm 處的熒光強(qiáng)度的比值(F609/F534)與 c(Zn2+)/c(DBITA)作圖可知，F(xiàn)609/F534比值與c(Zn2+)total呈線性關(guān)系(圖1a 插圖)，比值大約從0.3 增強(qiáng)到1.5。 由于DBITA 存在由從推電子基團(tuán)N，N-二甲基到咪唑以及吡啶單元的ICT 效應(yīng)， 當(dāng)DBITA 與Zn2+結(jié)合后，PBI 與Zn2+配位后不僅會(huì)使芳環(huán)平面性增強(qiáng)， 共軛程度增加，波長(zhǎng)發(fā)生紅移，而且由于Zn2+的拉電子作用導(dǎo)致拉電子單元拉電子能力增強(qiáng)， 使分子內(nèi)的ICT 效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，同樣也會(huì)導(dǎo)致波長(zhǎng)發(fā)生紅移。這兩種效應(yīng)的疊加是導(dǎo)致DBITA 與Zn2+結(jié)合后波長(zhǎng)紅移要比PBITA 與Zn2+結(jié)合所導(dǎo)致的波長(zhǎng)紅移大的主要原因。 另外，在含EGTA/Zn2+的HEPES 緩沖溶液中對(duì)DBITA 的Zn2+配合物的Kd值進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DBITA 與Zn2+的結(jié)合能力要遠(yuǎn)高于PBITA(表S1)，配合物DBITA/Zn2+的Kd值為0.16 pmol·L-1(圖S3)，原因可能是因?yàn)镹，N-二甲基較強(qiáng)的供電子能力增強(qiáng)了咪唑N 原子的配位能力。

圖1 Zn2+對(duì)10 μmol·L-1 DBITA 在HEPES 溶液中的熒光(a)和紫外(b)滴定光譜圖； (a) 中插圖為F609/F543 滴定曲線,(b)中插圖為340 nm 波長(zhǎng)處的紫外滴定曲線Fig.1 (a) Emission spectra of 10 μmol·L-1 DBITA (λex, 362 nm) in HEPES buffer solution； Inset in the titration profile based on the emission ratio at 609 and 543 nm, F609/F543； (b) Absorption spectra of 10 μmol·L-1 DBITA in HEPES buffer when titrated with Zn2+(1.2 mmol·L-1) solution； Inset in Zn2+titration profile according to the absorbance at 340 nm

2.4 DBITA 與Zn2+結(jié)合方式

2.4.1 紫外滴定實(shí)驗(yàn)

進(jìn)一步采用紫外滴定、 核磁滴定和質(zhì)譜研究了DBITA 與Zn2+結(jié)合方式。 紫外滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)在DBITA 的HEPES 溶液中滴加Zn2+以后，DBITA在340 nm 處的吸收峰逐漸降低，并伴隨有明顯的紅移，移動(dòng)到364 nm 處(圖1b)。 PBITA 吸收峰的紅移是Zn2+誘導(dǎo)的芳環(huán)共面導(dǎo)致的結(jié)果。 而對(duì)于DBITA來(lái)說(shuō)， 由于同時(shí)存在Zn2+誘導(dǎo)的芳環(huán)共面以及ICT效應(yīng)的改變，使其吸收峰的紅移距離(Δλabs=24 nm)要大于PBITA(Δλabs=15 nm)。 DBITA 的滴定光譜中在359 nm 處出現(xiàn)了等消光點(diǎn)，這表示自由配體已完全轉(zhuǎn)化為一種鋅的配合物。用340 nm 處的吸收峰吸收強(qiáng)度對(duì)c(Zn2+)total/c(DBITA)作圖可知：當(dāng)c(Zn2+)total/c(DBITA)≤1 時(shí)，紫外吸光度的降低與總鋅濃度呈線性關(guān)系；而當(dāng)c(Zn2+)total/c(DBITA)＞1 時(shí)，更高的總鋅濃度也不會(huì)再使光譜發(fā)生明顯的改變。 這表明所生成的Zn2+配合物的化學(xué)計(jì)量比為1∶1。

2.4.2 核磁滴定實(shí)驗(yàn)

Zn2+對(duì)DBITA 的核磁滴定實(shí)驗(yàn)在CD3OD 體系中進(jìn)行。 由圖2 可以看出，隨著Zn2+的加入，除了自由的DBITA 的信號(hào)峰外(圖2c)， 還出現(xiàn)了另一組Zn2+/DBITA 配合物的信號(hào)峰。當(dāng)c(Zn2+)total/c(DBITA)=0.5 時(shí)，兩組信號(hào)峰的強(qiáng)度基本相同(圖2b)；然而其比值達(dá)到1 時(shí)， 則只能觀察到Zn2+配合物的信號(hào)峰(圖2a)。 加入更多的Zn2+也不會(huì)引起核磁譜的進(jìn)一步變化。這同樣也證實(shí)了DBITA 與Zn2+的結(jié)合比為1∶1。

詳細(xì)的信號(hào)峰的指認(rèn)結(jié)果列于表S2。 Zn2+的配位使得探針的所有質(zhì)子的信號(hào)都發(fā)生了改變， 這表明吡啶環(huán)上的氮原子以及咪唑環(huán)的氮原子都可能參與了Zn2+的直接配位。 因此， 我們推測(cè)Zn2+與DBITA 的結(jié)合模式可能如圖2d 所示。

圖2 Zn2+對(duì)DBITA 在CD3OD 中的1H 核磁滴定譜圖Fig.2 1H NMR spectra of DBITA in CD3OD upon Zn2+titration

2.4.3 配合物質(zhì)譜研究

DBITA 的Zn2+配合物的電噴霧質(zhì)譜結(jié)果如圖3所示，在DBITA/Zn2+配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜中可以觀察到2 個(gè)峰：256.83 處較低的峰為配合物的二價(jià)峰[DBITA+Zn2+]2+；512.33 處的峰可以歸屬為配合物的一價(jià)峰[DBITA+Zn2+-H]+。 這些離子峰的同位素分布方式與ISOPRO 3.0 模擬的結(jié)果基本一致，這進(jìn)一步表明了DBITA 與Zn2+結(jié)合方式為1∶1 結(jié)合。

2.5 DBITA 與Zn2+結(jié)合的選擇性研究

對(duì)金屬離子的選擇性熒光響應(yīng)是一個(gè)合格探針?biāo)仨毦哂械闹匾墓鈱W(xué)性質(zhì)。 因此我們?cè)贒MSOH2O 體系中對(duì)DBITA 與Zn2+結(jié)合的選擇性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4a)表明，在生命體相關(guān)的金屬離子存在下，DBITA 對(duì)Zn2+和Cd2+有較好的選擇性比例計(jì)量響應(yīng)(F609/F534)，其它的金屬陽(yáng)離子，如等濃度的Cu2+，Hg2+，Pb2+，CO2+，Ni2+、Mn2+、Fe2+以及1 000 倍的堿金屬和堿土金屬離子等都對(duì)配體熒光強(qiáng)度無(wú)明顯影響。 由各種離子存在下DBITA 在609 和534 nm 處的熒光強(qiáng)度的比值可知，Zn2+和Cd2+在2 個(gè)波長(zhǎng)下強(qiáng)度的比值都在1.6 左右， 而其余金屬離子的比值都在0.3 左右，因此DBITA 對(duì)Zn2+的比例計(jì)量行為不會(huì)受到除Cd2+外其他金屬離子的干擾。 以上結(jié)果表明，DBITA 與大部分Zn2+探針類(lèi)似， 難以排除處同一族性質(zhì)極為相似的Cd2+對(duì)其增強(qiáng)以及比例計(jì)量行為的干擾。 但由于正常細(xì)胞或生命體內(nèi)沒(méi)有Cd2+，所以不會(huì)對(duì)Zn2+的響應(yīng)帶來(lái)干擾。

圖3 DBITA/Zn2+配合物的正離子電噴霧質(zhì)譜Fig.3 MS spectrum of DBITA/Zn2+complex

圖4 (a) HEPES 緩沖溶液中(50 mmol·L-1, pH 7.2, 0.1 mol·L-1 KNO3), 金屬離子對(duì)10 μmol·L-1 DBITA 的熒光選擇性響應(yīng)柱狀圖(F609/F534, λex=362 nm)； 其中Zn2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Pb2+、Mn2+、Fe2+的含量與DBITA含量相同, Na+、K+、Ca2+、Mg2+的含量是DBITA 含量的1000 倍； (b) DBITA 及其Zn2+配合物(10 μmol·L-1)在609 和543 nm 波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度比值隨pH 變化曲線Fig.4 (a) Emission ratio at 609 and 543 nm of DBITA (10 μmol·L-1, λex=362 nm) induced by different metal cations in HEPES buffer (50 mmol·L-1, pH 7.2, 0.1 mol·L-1 KNO3)； Final concentration for Zn2+, Cd2+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, Mn2+,Ni2+, Hg2+, Co2+and Pb2+is 10 μmol·L-1, for Na+, K+, Ca2+, and Mg2+is 0.10 mmol·L-1, (b) Emission ratio F609/F534 of DBITA and DBITA/Zn2+complex (10 μmol·L-1) in aqueous solutions with different pH values, λex=362 nm

進(jìn)一步研究了pH 變化對(duì)DBITA 的Zn2+比例計(jì)量響應(yīng)行為的影響。 如圖4b 所示，DBITA 在609和534 nm 處的熒光強(qiáng)度的比值只在酸性條件下才會(huì)增強(qiáng)， 而在pH≥5 的范圍內(nèi)基本保持不變，而DBITA/Zn2+配合物的比值在pH 4～8 之間穩(wěn)定，因此可以認(rèn)為DBITA 對(duì)Zn2+比例計(jì)量行為不受pH干擾，非常適合于生理環(huán)境下Zn2+的響應(yīng)。

2.6 DBITA 對(duì)細(xì)胞內(nèi)Zn2+的造影性能研究

由于DBITA 對(duì)Zn2+發(fā)射波長(zhǎng)紅移的比例計(jì)量響應(yīng)， 因此我們利用雙通道對(duì)DBITA 在細(xì)胞內(nèi)的Zn2+造影能力進(jìn)行了研究。 雖然DBITA 的最大激發(fā)波長(zhǎng)在362 nm， 但從激發(fā)光譜上可以看出在405 nm 處仍可以對(duì)DBITA 進(jìn)行激發(fā)。 因此，為了減小紫外激發(fā)對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的光損傷， 我們選用了波長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)的405 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)DBITA 進(jìn)行了造影研究。 根據(jù)圖S4 可知，用405 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)DBITA 的金屬離子選擇性以及Zn2+的比例計(jì)量響應(yīng)幾乎沒(méi)有影響， 在熒光增強(qiáng)的作用上Zn2+導(dǎo)致的熒光增強(qiáng)4.95 倍增加到6.35 倍，而Cd2+導(dǎo)致的熒光增強(qiáng)5.12 倍增加到5.31 倍。

圖5 DBITA 對(duì)HeLa 細(xì)胞內(nèi)的激光共聚焦雙通道成像: (a, e, i) HeLa 細(xì)胞用DBITA(10 μmol·L-1)溶液25 ℃孵育20 min； (b, f, j)將染色細(xì)胞暴露于5 μmol·L-1 Zn(NO3)2/2-巰基吡啶-N-氧化物溶液中5 min, 然后再用DBITA溶液孵育20 min 成像； (c, g, k)進(jìn)一步用TPEN 溶液(25 μmol·L-1, 20 min)處理(b, f, j)中的細(xì)胞； (a, b, c) 500～540 nm 通道熒光圖像； (e, f, g) 580～620 nm 通道熒光圖像； (i, j, k)由(e, f, g)和(a, b, c)生成的比例圖像,λex=405 nm； (d)與(a～c)中所示圖像對(duì)應(yīng)的平均信號(hào)強(qiáng)度柱狀圖； (h) 與(e～g) 中所示圖像對(duì)應(yīng)的平均信號(hào)強(qiáng)度柱狀圖； (l)與(i～k) 中所示圖像對(duì)應(yīng)的平均比值柱狀圖Fig.5 Dual emission ratiometric imaging of intracellular Zn2+in HeLa cells via DBITA (10 μmol·L-1, 20 min) staining at 25 ℃:(a, e, i) HeLa cells incubated with DBITA at 25 ℃for 20 min； (b, f, j) the stained cells were exposed to 5 μmol·L-1 Zn(NO3)2/2-mercaptopyridine-N-oxide solution at 25 ℃for 5 min, followed by washing with DBITA solution, (c, g, k) the cells in (b, f, j) further treated by TPEN solution (25 μmol·L-1, 20 min, bottom)； (a, b, c) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 500～540 nm； (e, f, g) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 580～620 nm； (i, j, k) Ratiometric images generated from (e, f, g) and (a, b, c), λex=405 nm； (d) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (a～c)； (h) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (e～g)； (l) Histogram of the average ratio value corresponding to images shown in (i～k)

DBITA 溶液對(duì)HeLa 細(xì)胞造影結(jié)果如圖5 所示。 綠色通道收集500～540 nm 熒光，紅色通道收集580～620 nm 熒光；熒光比值為綠色通道熒光與紅色熒光通道比值。 HeLa 細(xì)胞經(jīng)DBITA 溶液染色后，2個(gè)通道的比值非常低，約為0.098±0.011(圖5i)；這表明細(xì)胞中的游離Zn2+相對(duì)較低，DBITA 主要以游離形式存在。 用Zn(NO3)2/pyrithione 溶液孵育后，再加入DBITA 溶液， 紅色通道的熒光強(qiáng)度信號(hào)由117±59(圖5e)增加到2 678±348(圖5f)，綠色通道的熒光強(qiáng)度信號(hào)由1 232±69(圖5a)增加到3 871±116(圖5b)；因此，熒光信號(hào)的比值明顯增加，大多數(shù)細(xì)胞的比值在0.73±0.04 左右，少數(shù)細(xì)胞的比例增加到1.0左右(圖5j)。這表明外源性Zn2+的加入增加了細(xì)胞中Zn2+的濃度，DBITA 與Zn2+結(jié)合后導(dǎo)致比值增大。繼續(xù)將HeLa 細(xì)胞用TPEN 溶液孵育20 min 后進(jìn)行造影，結(jié)果如圖5k，細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)通道的比值明顯下降，約為0.45±0.04，但仍高于細(xì)胞的初始比例。 這是由于DBITA 對(duì)Zn2+有很強(qiáng)的螯合能力，即使在高濃度的TPEN 存在下，DBITA 螯合的Zn2+仍不能完全被去除。 以上結(jié)果表明，DBITA 具有良好的細(xì)胞膜透性，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中Zn2+比值檢測(cè)。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鋅過(guò)量會(huì)對(duì)發(fā)育和成熟的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。例如， 谷氨酸能突觸釋放過(guò)多的Zn2+是導(dǎo)致缺血時(shí)神經(jīng)元死亡的原因[4]，視神經(jīng)損傷后Zn2+的積累導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡[62]。 同樣，細(xì)胞內(nèi)Zn2+的激增也與對(duì)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的興奮性毒性或硝化性損傷有關(guān)[63-65]。 DBITA 具有體內(nèi)Zn2+過(guò)多的診斷和治療潛力。

3 結(jié) 論

綜上所述，以2-PBI 為熒光團(tuán)，通過(guò)在PBI 的5-位引入強(qiáng)的推電子基團(tuán)N，N-二甲基，設(shè)計(jì)了Zn2+結(jié)合誘導(dǎo)發(fā)射光譜紅移的比例計(jì)量型Zn2+探針DBITA。當(dāng)探針與Zn2+結(jié)合后，可發(fā)生Zn2+誘導(dǎo)的芳環(huán)翻轉(zhuǎn)/共面， 從而使發(fā)射峰發(fā)生較大距離的紅移。進(jìn)一步用紫外-可見(jiàn)光譜、 核磁共振氫譜和質(zhì)譜研究了DBITA 與Zn2+的1∶1 結(jié)合行為。 在HeLa 細(xì)胞內(nèi)的比例計(jì)量造影實(shí)驗(yàn)表明，DBITA 能夠應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)Zn2+的定量檢測(cè)。 本研究進(jìn)一步證明，通過(guò)Zn2+誘導(dǎo)的芳環(huán)翻轉(zhuǎn)/共面是構(gòu)筑比例計(jì)量型Zn2+熒光探針的有效策略。 這一策略應(yīng)該適合于2，2′-氮雜-1，1′-二芳基型熒光團(tuán)的比例計(jì)量型探針的設(shè)計(jì)。

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