李云貴，軒貴平，姚海倫，鄒 柳

(1 湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南 衡陽 421001；2 柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 454001)

燈盞花素(breviscapine)又叫燈盞細辛，是菊科植物短葶飛蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz)的干燥全草，其中主要成分是燈盞花乙素(又叫野黃芩苷)，另還含少量燈盞花甲素，其中燈盞乙素的含量占95%以上，為燈盞花素的主要有效成分[1]。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明：燈盞花素可以改善心腦微循環(huán)、增加血流量、抗氧化、抗炎及拮抗心機缺血再灌注損傷等藥理作用[2-6]，其中最顯著的作用是保護心腦血管[7-9]。目前上市的燈盞花素制劑中依然存在著生物利用度低，體內(nèi)消除迅速，半衰期短等缺點。

為此，針對燈盞花素水溶性和脂溶性均差的特性，本實驗選用以經(jīng)SFDA認證的安全高分子材料聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為聚合物脂質(zhì)體載體材料包載燈盞花素，制備燈盞花素聚合物脂質(zhì)體。

1 材 料

1.1 儀 器

KQ-250DE型超聲儀，昆山市超聲儀器公司；UV-1750紫外分光光度儀，島津公司；Nano-ZS粒度測定儀，英國Malvern公司；XW-80A旋渦混合器，上海醫(yī)科大學儀器廠；AG285型電子分析天平，瑞士METTLER公司；EM-1200EX透射電子顯微鏡，日本電子公司；X-射線衍射儀，日本Rigaku公司。

1.2 試 藥

燈盞乙素標準品，中國藥品生物制品檢驗所(批號：201707)；燈盞花素原料藥，湖南恒生制藥有限公司(批號：20180506)；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯，阿拉丁試劑有限公司(批號：20180323)；其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 燈盞花素儲備液的制備

精密稱取50 mg燈盞花素原料藥，置棕色容量瓶中，加入適量甲醇使其完全溶解后定容，最終得到1 mg/mL的燈盞花素儲備液，置4 ℃冰箱中保存、備用。

2.2 聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯儲備液的制備

精密稱取聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯2.00 g，放入容量瓶中，加入適量甲醇進行溶解，稀釋、定容至刻度，制得20 mg/mL的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯儲備液，置4 ℃冰箱中保存、備用。

2.3 建立UV法測定Bre/TPGS脂質(zhì)體的含量

2.3.1 檢測波長的確定

取適量燈盞花素儲備液，放入棕色容量瓶中，加入適量的甲醇溶液進行稀釋、定容至刻度處，輕輕搖晃均勻，配制成0.04 mg/mL 的燈盞花素溶液，以甲醇溶液為空白參比，用UV法進行紫外吸收波長掃描來確定其最大吸收波長。

2.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取50 mg燈盞乙素標準品，置棕色容量瓶中，加入適量甲醇待其完全溶解后定容，搖勻，即得100 μg/mL的燈盞乙素標準品溶液。再用甲醇稀釋定容至刻度，制備成濃度分別為4.00、6.00、8.00、10.00、12.00和14.00 μg/mL的一系列燈盞乙素標準品溶液。按照UV法確定的燈盞花素最適吸收波長處對這一系列標準品溶液進行測定，得系列標準品溶液的吸光度值(A)，以吸光度值對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.3.3 精密度考察

分別配制低(4μg/mL)、中(8 μg/mL)、高(12 μg/mL)三種不同濃度的燈盞乙素標準品溶液，每個濃度設置三個平行組，按照UV法確定的最適宜的吸收波長在同一天內(nèi)測定5次吸光度值A，考察其日內(nèi)精密度，計算RSD。同法，用上述樣品每天測定1次連續(xù)測定3 天吸光度值A，考察其日間精密度，計算RSD。

2.3.4 方法回收率

分別配制低(4 μg/mL)、中(8 μg/mL)、高(12 μg/mL)三種不同濃度的燈盞乙素標準品溶液，每個濃度設置三個平行組，按照UV法確定的最適吸收波長的吸光度值(A)，根據(jù)繪制的標準曲線方程，計算出燈盞乙素的實際測定濃度，可得出其方法回收率，即實際濃度/理論濃度×100%。

2.4 Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯儲備液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入7.00 mL的燈盞花素儲備液(1 mg/mL)，攪拌混勻后，用減壓旋轉蒸發(fā)回收甲醇，然后再加入蒸餾水10 mL，于37 ℃磁力攪拌2 h，再加甲醇溶解、攪拌，減壓回收甲醇，用微孔濾膜過濾，即得Bre/TPGS脂質(zhì)體。同上述方法，不加入燈盞花素即制得空白脂質(zhì)體。

2.5 脂質(zhì)體包封率及載藥量的測定

精密吸取1.00 mL 的Bre/TPGS脂質(zhì)體溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋、定容到刻度，再從上述溶液中精密吸取3.00 mL溶液，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋、定容到刻度，超聲10 min。測定脂質(zhì)體中燈盞花素的含量，計算其的包封率(EE%)和載藥量(DL%)。

包封率=M0/M1×100%

載藥量=M0/M ×100%

式中：M為所制備的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與燈盞花素總投入的量；M0為脂質(zhì)體中燈盞花素的量；Ml為脂質(zhì)體前投入燈盞花素的量。

2.6 單因素法篩選Bre/TPGS的制備工藝

在實驗過程影響聚合物脂質(zhì)體形成的因素有很多，根據(jù)預實驗基礎，選取了水化溫度、水化時間和藥物與載體藥物比等三個單因素進行考察，為下一步實驗設計提供依據(jù)。

2.6.1 水化溫度對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

精密吸取5.00 mL的Bre/TPGS脂質(zhì)體儲備液(20 mg/mL)，放入茄型瓶中，加入5.00 mL的燈盞花素儲備液(1 mg/mL)，磁力攪拌混勻后，減壓回收甲醇，然后再加入蒸餾水10 mL，于水化溫度為37、50、60 ℃溫度條件下磁力攪拌3 h，再加甲醇溶解、攪拌，減壓回收甲醇，用微孔濾膜過濾，即為Bre/TPGS脂質(zhì)體。

2.6.2 水化時間對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯儲備液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入5.00 mL的燈盞花素儲備液(1 mg/mL)，磁力攪拌混勻后，用減壓回收甲醇，然后再加入蒸餾水10 mL，于水化溫度為37 ℃下磁力攪拌1、2、3、4、5 h，再加甲醇溶解、攪拌，減壓回收甲醇，用微孔濾膜過濾，即為Bre/TPGS脂質(zhì)體。

2.6.3 藥物與載體藥物比對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯儲備液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入不同體積的燈盞花素儲備液(1 mg/mL)，磁力攪拌混勻后，減壓回收甲醇，然后再加入蒸餾水10 mL，于水化溫度為37 ℃下磁力攪拌3 h，再加甲醇溶解、攪拌，減壓回收甲醇，用微孔濾膜過濾，即為Bre/TPGS脂質(zhì)體。

2.7 正交實驗優(yōu)化Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝

通過正交實驗來進一步優(yōu)化Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝，選擇包封率為考察指標，考察了藥物與載藥量的比值(A)、水化溫度(B)、水化時間(C)對脂質(zhì)體包封率的影響，每個因素考察 3 個水平。設計L9(33)正交設計表，進行三因素、三水平正交實驗，篩選出制備Bre/TPGS脂質(zhì)體的最佳工藝。正交實驗水平見表1。

表1 正交設計因素水平表

3 結果與討論

3.1 Bre/TPGS脂質(zhì)體的含量測定結果

3.1.1 檢測波長的確定

分別取燈盞花素甲醇溶液和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯甲醇溶液進行紫外掃描，確定燈盞花素檢測波長為335 nm。

3.1.2 標準曲線的繪制

采用UV法在335 nm 處分別測定已配置好一系列濃度的燈盞乙素標準品溶液的吸光度(A)，測定的數(shù)據(jù)結果見表2。其線性方程為：Y=0.0564X-0.0054，R2=0.9998。用于Bre/TPGS脂質(zhì)體的含量測定。

表2 燈盞花素標準溶液標吸光度值A

3.1.3 精密度試驗

低、中、高三種不同濃度燈盞乙素標準溶液的日內(nèi)精密度實驗結果見表3，日間精密度實驗結果見表4。日內(nèi)和日間精密度良好，RSD均小于3%，符合樣品含量測定要求。

表3 燈盞花素日內(nèi)精密度實驗結果

表4 燈盞花素日間精密度實驗結果

3.1.4 方法回收率試驗

低、中、高三種不同濃度的燈盞乙素溶液的方法回收率實驗結果見表5，RSD小于3%，表明此測定方法符合含量測定要求。

表5 燈盞花素方法回收率實驗結果(n=3)

3.2 Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝篩選結果

3.2.1 水化溫度對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

固定藥物與載體比例與水化時間，在制備過程中考察水化溫度對脂質(zhì)體的粒徑、包封率和載藥量的影響。從表6可知水化溫度對聚合物的粒徑影響較小，37 ℃時制備的聚合物脂質(zhì)體的包封率和載藥量較高。

溫度/℃粒徑/nm包封率/%載藥量/%3717.32±1.3294.57±2.184.50±0.115015.07±1.1280.25±3.253.81±0.126016.71±1.6984.33± 2.214.01±0.06

3.2.2 水化時間對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

固定藥物與載體比例與水化溫度，在制備過程中考察水化時間對脂質(zhì)體的粒徑、包封率和載藥量的影響。從表7中可知，脂質(zhì)體的粒徑受水化時間的影響變化不大，在3 h時藥物的包封率達到94.57%。

水化時間/h粒徑/nm包封率/%載藥量/%128.31±2.3280.25±3.153.80±0.04223.86±1.2286.25±1.254.11±0.05317.32±1.3294.57±2.184.50±0.11421.84±1.6983.33±3.213.96±0.15527.42±3.2672.46±1.743.45±0.08

3.2.3 藥物與載體比例對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響

從表8中數(shù)據(jù)可知，固定水化溫度與水化時間，在制備過程選取6個不同藥物與載體比考察其對脂質(zhì)體的粒徑、包封率和載藥量的影響。

表8 不同藥物與載體比例對Bre/TPGS脂質(zhì)體的影響n=3)

3.3 Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化結果

通過正交實驗來進一步優(yōu)化Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝，選擇包封率作為考察指標，考察藥物與載藥量的比值(A)、水化溫度(B)、水化時間(C)對脂質(zhì)體包封率的影響。根據(jù)L9(33)正交設計表，進行三因素、三水平正交實驗，篩選出制備Bre/TPGS脂質(zhì)體最佳工藝。

3.4 正交實驗最佳制備工藝的驗證

精密稱取100 mg聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯，置茄型瓶中，加入7.00 mL燈盞花素甲醇溶液(1 mg/mL)，攪拌混勻后，減壓回收甲醇，然后再加入蒸餾水10 mL，在37 ℃水化溫度，磁力攪拌水化2 h，再加甲醇溶解，減壓回收甲醇，用微孔濾膜過濾，按照此最優(yōu)方法制備3批Bre/TPGS脂質(zhì)體。 Bre/TPGS脂質(zhì)體的包封率為90%±2.62%(n=3)，RSD為2.36%。該結果表明，A2B1C2實驗方案的實驗結果重現(xiàn)性良好，即制備的Bre/TPGS脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性。

4 討 論

燈盞花素在波長335 nm處有最大吸收峰，且載體藥物聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯在此波長處不干擾藥物的含量測定，具有良好專屬性和精密度。實驗證明，采用薄膜溶劑揮發(fā)法制備Bre/TPGS脂質(zhì)體，包封率與載藥量有較大提高。實驗的過程中，選擇對載藥量和包封率影響較大的單因素，進行L9(33)正交設計實驗來優(yōu)選Bre/TPGS脂質(zhì)體的制備工藝。通過該法制備聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯脂質(zhì)體工藝簡單，其粒徑、包封率、載藥量均可控，并具有一定的緩釋作用，為進一步臨床應用提供參考。