張力弦　王啟扉　曹楊　葉承宇　陳智洋　徐啟杰　鄒秉杰　宋沁馨　周國華

摘 要 基因編輯技術已成為醫(yī)學生物學研究的重要工具，將不同基因快速高效地富集到基因編輯陽性細胞并進行針對性研究是促進基因編輯技術發(fā)展的關鍵。近年來，基于非同源末端接合、同源直接修復、單鏈退火、倒位重排等基因組修復機制，研究者利用熒光蛋白或抗性標簽基因修復后表達的原理， 建立了多種可用于基因編輯陽性細胞篩選與富集的報告系統(tǒng)。富集后的細胞采用T7E1酶切法或測序技術進行突變分析， 呈現(xiàn)顯著降低的背景信號和增加的突變比例。此類報告系統(tǒng)有利于基因編輯效果的表征。此外，分選后的陽性細胞可繼續(xù)培養(yǎng)，在突變細胞系構建及突變細胞功能研究等領域具有良好的發(fā)展前景。本文對這些報告系統(tǒng)的設計原理與應用進行了總結，以期為建立更加完善的基因編輯評價系統(tǒng)提供參考。

關鍵詞 基因編輯; 修復機制; 細胞富集; 報告系統(tǒng); 評述

1 引 言

基因工程始于猴病毒SV40與大腸桿菌噬菌體λDNA首次拼接成環(huán)實驗[1]，隨后，同源重組（Homologous recombination， HR）和非同源末端接合等基因修復機制以及核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)與研究為現(xiàn)代基因編輯技術提供了理論基礎[2，3]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些基于長序列識別的核酸酶，如大范圍核酸酶（Meganuclease）[4～7]或歸巢核酸內切酶（Homing endonuclease）、鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[8～12]、轉錄激活樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases， TALENs）[13～17]、結構識別核酸酶（Structure-guided nuclease， SGN）[18]，以及成簇規(guī)律間隔短回文重復相關核酸酶Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein Cas9，CRISPR/Cas9）[19～22]。上述核酸酶可精確地識別靶序列并誘導雙鏈斷裂（Double-stand break， DSB），繼而通過同源直接修復（Homology directed repair， HDR）[23]或非同源末端接合（Non-homologous end joining， NHEJ）[24]等方式實現(xiàn)對靶序列的編輯。基因編輯技術通過不同的轉染技術，如脂質體、電穿孔、病毒包裝、穿膜肽等[25]，已經應用于疾病模型的建立[26～28]、基因治療[29]、基因篩選[30]等各個領域。然而，基因編輯工具固有的脫靶效應[31，32]可能在實際應用中誘導非靶點編輯、錯誤表型或致死等副作用，如T7E1酶切試驗及靶點所在片段的擴增子測序分析僅能反映局部脫靶效應，因此，只有針對全基因組的深度測序[33]才能對脫靶效應進行合理的評價。在降低脫靶效應方面，采用LNA取代[34]、2'-F、2'-O-Me、2'-O-Me 3'-硫代磷酸脂、2'-O-Me 3'-硫代磷乙酸[35～36]等化學合成堿基取代的sgRNA顯著降低了Cas9脫靶效應并提高了編輯效率;替換Cas9蛋白中氨基酸序列， 可產生特異性更高或識別范圍更廣泛的突變體Cas9x[37]。

不同細胞系、基因位點和基因編輯工具等差異因素會顯著影響編輯效率，導致基因編輯陽性細胞占比較少，大量野生型細胞會對突變分析產生干擾。雖然高通量深度測序能分辨突變序列，但其成本較高、數(shù)據(jù)分析難度較大，并且無法進行后續(xù)細胞培養(yǎng)研究。通常情況下，T7E1酶切試驗可作為DNA水平編輯效率的早期評價方案用于篩選到最優(yōu)的反應體系。然而，如果繼續(xù)研究基因組產生突變的活細胞，則需要建立一種可直觀、快速且高效富集陽性細胞的方法。目前，借助基因編輯工具酶靶向與熒光蛋白（mRFP、mCherry、DsRed、AsRED、eGFP）或抗性蛋白（嘌呤霉素、潮霉素）序列整合的外源性目的基因，再利用HDR、NHEJ、單鏈退火（Single strand annealing，SSA）和倒位重排[38]等修復機制誘導讀碼框位移來實現(xiàn)功能蛋白的表達，以此來表征基因編輯陽性結果的相關方法被相繼報道。后續(xù)通過流式細胞熒光分選技術（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）或抗性篩選等手段完成基因編輯陽性細胞的高效富集，具有通用性強、快速檢測、分析簡便等優(yōu)勢，且此類報告系統(tǒng)已在多種基因編輯工具驗證中得到了應用（表1）。本文主要針對基于NHEJ、SSA、HDR、倒位重排這4種基因修復機制的報告系統(tǒng)及其在基因編輯陽性細胞分選和富集方面的應用進行評述。

2 基因組修復機制

ZFN或TALEN通過Fok I對目的基因雙鏈造成5'端突出的粘性末端，而Cas9依靠自身內部的RuvC和HNH兩個切割域對PAM上游第3和第4個堿基之間產生平頭末端[51]。 以上兩種形式的DSB均會觸發(fā)基因組修復。NHEJ通常導致斷裂處的堿基缺失、插入或替換（圖1A），這是一種有錯誤傾向的修復方式，一般用于基因敲除，而對病理性插入突變的兩端造成兩個DSB，NHEJ則會恢復基因表達[52]。HDR與SSA均屬于依賴同源臂的同源重組修復機制。當含有DSB上下游同源序列的供體存在時，斷裂位點依據(jù)供體序列進行精確修復，可以逆轉病理突變或插入功能性基因（圖1B）。SSA的觸發(fā)條件是在一對較長的直接重復序列之間的間隔區(qū)發(fā)生DSB，切口處自5'端向3'端消化，隨后3'突出末端處的互補序列退火完成修復（圖1C）。染色體倒位重排（圖1D）與多種遺傳疾病和腫瘤發(fā)生相關[50]，多發(fā)生于一段長序列兩端同時斷裂，而后該段序列方向顛倒180°。

3 細胞內游離的外源性報告系統(tǒng)

將靶序列整合至基于不同修復機制的外源性報告質粒，并與基因編輯工具酶表達質粒共轉染至細胞中，即可通過熒光蛋白或抗性基因的表達情況來表征基因編輯的效果。

綜上所述，NHEJ修復機制作為報告系統(tǒng)的優(yōu)勢在于極為簡單的報告載體設計，依靠修復后產生的堿基缺失或插入使開放閱讀框位移，從而實現(xiàn)報告功能。但是，由于缺失或插入的堿基數(shù)必須滿足3n+1或3n+2（n≥0且n∈N）個，因此其它形式的突變通常無法被準確反映。

3.4 基于SSA的雙熒光報告系統(tǒng)

2014年， Zhang等[43]設計了一種“自降解”ZFN表達盒偶聯(lián)雙熒光報告系統(tǒng)的質粒（mRFP-GFPleft-target-ZFN-target-GFPright，pRGZG）。該系統(tǒng)下游eGFP序列被打斷成兩段（GFPleft和GFPright），二者的3'和5'端共享200 bp的直接重復序列，ZFN左右臂的表達序列插入其中，另外兩對ZFN左右臂的靶標（Target）分別置于ZFN表達盒的上下游。當ZFN表達后不僅會切割基因組靶標，也會識別并切割報告質粒上的靶標并引發(fā)SSA修復，重組為完整的eGFP表達序列; 而ZFN表達盒則會被消化，使得ZFN表達終止，實現(xiàn)阻斷ZFN持續(xù)性表達并降低細胞毒性的作用。pRGZG對ZFN誘導的MSTN突變的羊胎成纖維細胞富集到18.33%的mRFP+eGFP+細胞，且同對照組相比，細胞活性僅下降約20%，而正常轉染ZFN的細胞活性下降約40%。由此可見，pRGZG系統(tǒng)既可高效富集基因編輯陽性細胞，又可降低ZFN的細胞毒性。

盡管ZFN的組裝平臺較為成熟，但每個鋅指酶依靠內部3個氨基酸殘基識別3個堿基，因此十分依賴上下游序列的設計，而且其細胞毒性也不容忽視[57]。與之相比，CRISPR/Cas9技術僅需要設計與靶標互補的sgRNA序列，即可配合Cas9蛋白實現(xiàn)對目的基因的操縱[51]，極大程度地簡化了實驗前設計步驟。2016年，Zhou等[44]設計了基于SSA修復機制的C-Check報告質粒（圖4）。C-Check由兩個表達盒組成：一對用于引發(fā)SSA修復的截斷eGFP表達序列和用于測定轉染效率以及確立標準化的AsRED表達序列。eGFP被拆分為1～600 bp和100～720 bp兩個片段，使其熒光性質被徹底干擾。同時，兩部分共享500 bp的同源臂以便觸發(fā)SSA修復。

為驗證C-Check的功能，TALEN靶向HEK 293T細胞基因組中IAPP基因，F(xiàn)ACS分選后AsRED+ EGFP+的細胞占比約80%，對照組則低于10%。在較難轉染的原代豬成纖維細胞中，T7E1檢測到299%的突變比例，Sanger測序發(fā)現(xiàn)約3125%的突變目的基因。Cas9/sgRNA靶向HEK 293T細胞基因組中MAPT和SORL1基因，F(xiàn)ACS富集到117%～181%的雙熒光陽性細胞，而對照組僅為237%和291%。由于C-Check報告系統(tǒng)可以富集到可明顯區(qū)分于對照組的雙陽性細胞，證明其具備較高的報告性能。研究人員將C-Check與靶向IGF1R的Cas9/sgRNA表達質粒共轉染至HEK 293T細胞中，F(xiàn)ACS依據(jù)EGFP熒光信號由弱至強分選出4組分雙陽性細胞。擴增子分析顯示，插入缺失的發(fā)生頻率隨EGFP熒光強度增強而顯著提升（87%～979%），說明由CRISPR/Cas9誘導的IGF1R突變被高效富集。同樣，C-Check報告系統(tǒng)也在癌細胞MCF-7中富集到86.9%的CBX5基因突變細胞，其mRNA水平及CBX蛋白表達量降低，進一步證實了C-Check是一種高效富集基因編輯陽性細胞的報告系統(tǒng)。

上述外源性報告質粒多采取核酸酶表達質粒共轉染的策略，但雙組分進入細胞內的比例卻難以評估。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)最初需要Cas9表達質粒與tracr/crRNA復合物共轉染，Doudna與Charpentier將crRNA∶tracrRNA嵌合表達[58]（Single-guided RNA，sgRNA），使得Cas9/sgRNA實現(xiàn)單一質粒表達，從而提高了轉染效率。因此，若是將報告系統(tǒng)與Cas9/sgRNA表達質粒共包封為單一表達系統(tǒng)，可能會提高突變細胞富集效率。Liu等[57]將mCherry打斷為兩部分，各含有約300 bp的重復序列作為SSA修復臂，中間插入sgRNA靶標，再將mCherry表達盒整合到Cas9/sgRNA表達質粒中（sgRNA-mCherry-CRISPR，pSCR），copGFP用以表征轉染效率。T7E1檢測出copGFP+ mCherry+細胞中DAZL基因的3個靶位點的突變比例分別為24.79%、12.26%和17.18%，突變比例提高1.87、4.99和4.00倍。此外，使用雙拷貝sgRNA可使鼠黑色素瘤B16細胞基因組中PLZF和ACR基因突變富集率最高達5432%和40.49%。

雙熒光報告系統(tǒng)的優(yōu)點在于一種熒光蛋白負責指示轉染效率，另一種熒光蛋白指示基因編輯效率。因此，對雙熒光信號陽性的細胞進行富集分析可簡化和加快突變類型的研究。然而，兩種熒光蛋白的發(fā)射光波長存在一定程度的重合，由此產生的非特異性背景可能干擾FACS分選，導致假雙陽性細胞的混入，因此需要劃定適當?shù)拈撝狄员銋^(qū)分。

3.5 基于SSA的熒光-抗性-熒光報告系統(tǒng)

Ren等[46]設計了新型熒光-抗性-熒光報告質粒pSSA-RPG（DsRed-PuroR-eGFP）。其中PuroR基因被打斷為上游（PuroRL）、下游（PuroRR）兩部分，中間插入sgRNA識別位點以及PAM序列，PuroRL 5'末端與PuroRR 3'末端為共有的200 bp直接重復序列作為SSA修復臂，PuroRR下游以T2A剪切肽序列連接eGFP表達序列，且eGFP序列由于嘌呤霉素抗性基因序列被打斷而出現(xiàn)在正常的ORF以外，此時細胞會呈現(xiàn)DsRed+eGFPPuroR。當靶標產生DSB后會引發(fā)SSA修復，使得PuroRL與PuroRR重組為完整的嘌呤霉素抗性基因，ORF復位，eGFP正常表達，細胞呈現(xiàn)DsRed+eGFP+PuroR+。HEK 293T細胞基因組中4個位點AAVS1、CCR2、CCR5a和CCR5b經T7E1酶切法檢測，藥篩組中4個位點發(fā)生突變的比例為43.9%、57.8%、27.1%和24.7%，突變倍數(shù)達34.8、13.8、12.3和6.3倍，測序結果顯示突變比例分別為86.6%、72.7%、30.8%和45.0%，突變倍數(shù)達21.1、34.6、18.1和11.8倍。FACS富集DsRed+eGFP+的CCR5a突變細胞后，T7E1酶切檢測到31.4%的細胞為突變陽性，突變倍數(shù)達13.2，測序顯示突變比例與突變倍數(shù)分別為23.5%和11.2倍。

為了研究基于SSA修復機制的報告系統(tǒng)是否優(yōu)于前述的NHEJ報告系統(tǒng)，該課題組也設計了對應的報告質粒（pNHEJ-RPG），在完整的PuroR與eGFP序列前插入終止密碼子，原理同Kim等[39，40]的雙熒光報告質粒一致。AAVS1位點pSSA-RPG的富集效率比pNHEJ-RPG高1.15～1.34倍，呈現(xiàn)出較小幅度的效率提升。然而，分析pSSA-RPG序列發(fā)現(xiàn)，PuroRR存在數(shù)個ATG起始密碼子，或許在細胞內轉錄的過程中會發(fā)生下游eGFP的泄露表達，從而導致假陽性的結果出現(xiàn)，這是PuroR偶聯(lián)eGFP雙重陽性標志物共存的缺點。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，細胞基因組中單一等位基因被編輯的概率明顯高于雙等位基因[59～61]，但是，在疾病細胞模型構建、轉基因動物模型構建及基因治療等領域內，迫切需要快速篩選出雙等位基因突變的細胞。Wu等[47]將pSSA-RPG改造，構建出兩種整合型供體報告質粒（Reporter-intergrated donor，Rep/Don，圖5），其一在PuroR-eGFP表達組件上下游插入了基因組中靶標上下游的同源臂（Rep/DonPG），另一種則將兩側同源臂內側的報告序列更換為ZeoR-mRFP表達組件（Rep/DonZR）。將Rep/DonPG（圖5A）、Rep/DonZR（圖5B）與sgRNA-Cas9表達質粒共轉染至細胞中，當Cas9切割基因組和Rep/Don的靶標后，Rep/Don內部發(fā)生SSA修復使抗性-熒光蛋白恢復表達，外側同源臂則介導HDR，將PuroR-eGFP或ZeoR-mRFP整合進細胞基因組中。功能性熒光蛋白可作為初篩，反映Cas9切割活性，再進行Puro和Zeo雙重藥篩，即可高效篩選到雙等位基因修飾的細胞。人HEK293T細胞CCR5位點和豬PK15細胞Lnc-sscg3623位點雙等位基因突變比例達34.09%和18.18%，Rep/DonPG或Rep/DonZR單轉染對照組的雙等位基因突變率僅2.33%～6.81%，因此Rep/Don可以作為高效富集雙等位基因突變的報告系統(tǒng)。

基于SSA修復機制的外源性報告系統(tǒng)，由于其較高的修復效率，且無需考慮堿基數(shù)變化，因此受到越來越多研究者的青睞。此類報告系統(tǒng)與基于NHEJ的報告系統(tǒng)有一個共同的缺陷，即熒光蛋白的泄露表達或兩種熒光蛋白激發(fā)光波段的部分重合而導致的背景信號[61]。為了克服這一問題，多數(shù)研究將抗性篩選與熒光分選相結合，并利用指示性熒光蛋白進行熒光信號標準化處理，從而進一步提高特異性及富集效率。另外，Li等[56]的研究發(fā)現(xiàn)，提高sgRNA的表達量可直接增強Cas9切割效率，繼而對報告系統(tǒng)的富集率起促進作用。

4 細胞基因組整合的內源性報告系統(tǒng)

與外源性報告系統(tǒng)相比，將基于相應修復機制的報告系統(tǒng)整合進細胞基因組中，可構建內源性報告系統(tǒng)，如此無需考慮多種質粒共轉染的比例或轉染效率等問題，而且整合后的報告系統(tǒng)與目的基因拷貝數(shù)一致，可更準確地反映核酸酶對靶標造成的突變，也可提高富集后的突變比例。然而，構建穩(wěn)定表達細胞系常費時費力，因此整合型的內源性報告系統(tǒng)相關研究較少。

4.1 NHEJ介導的報告系統(tǒng)

D'astolfo等[48]設計了一種基于NHEJ修復機制的內源性dTomato報告系統(tǒng)（pdT）（圖6）。pdT結構為EF1a-ATG-AAVS1-dTomato，其中AAVS1作為靶序列的同時，也使得dTomato讀碼框位移而無法正常表達，當Cas9對AAVS1造成切割后，下游ORF移碼導致細胞呈現(xiàn)dTomato陽性。通過慢病毒載體構建出穩(wěn)定表達的KBM7和H1人胚胎干細胞。第一輪Cas9/sgRNA轉染后，KBM7細胞和H1人胚胎干細胞中dTomato強度分別達33.8%和10.2%，第二輪轉染后dTomato強度升至56.1%和26.3%，同時，脫靶實驗顯示dTomato的陽性信號約0.2%，遠低于實驗組的熒光強度。上述結果表明，dTomato報告系統(tǒng)可高效富集突變陽性細胞，但該課題組并未對目的基因的突變情況進行分析，需要進一步的測序結果來驗證該報告系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

4.2 HDR介導的報告系統(tǒng)

Piggybac轉座子（PB）可實現(xiàn)大片段DNA的高效整合，從而構建出外源基因穩(wěn)定表達的細胞系。Wen等[49]使用PB構建了供體依賴的熒光-抗性報告系統(tǒng)（Piggybac target vector，PTV），見圖7。高活性PB轉座子酶（hyPBase）將CMV-PuroR-pA-H2B-GFP-pA表達元件整合至細胞基因組，pA（polyadenylation signal）終止PuroR基因下游的GFP表達。同時，PuroR與GFP之間是一對Cas9D10A的識別序列。質粒供體含有PuroR-T2A-H2B-GFP序列，其中PuroR與H2B-GFP為PTV同源臂，PTV中的靶序列產生DSB后，PuroR-T2A-H2B-GFP序列在HDR機制下整合到報告系統(tǒng)。

HeLa和DLD1報告細胞系經FACS分選后，GFP+細胞分別約占8%和15%，T7E1酶切驗證NFE2L2位點突變率達33.1%和9.5%，較未分選組高2～4倍。將GFP序列替換為HygroR，藥篩富集到約60、120和100個存活DLD1細胞，3個基因位點（A1CF、RBM47和NFE2L2）突變率經T7E1酶切檢測分別為19.7%、51.5%和29.5%，非特異性gRNA對照組則相對降低1.4～3.0倍。盡管富集后細胞基因組的靶點突變倍數(shù)提升不高，但在HDR較低發(fā)生率的前提下，此系統(tǒng)確實對定向插入目的基因的研究有重要意義。

4.3 基于倒位重排的報告系統(tǒng)

染色體中的某些區(qū)域有較強的重排傾向，可導致遺傳性疾病或癌癥的發(fā)生。Li等[50]構建了一種可直接反映CRISPR/Cas9誘導的序列重排的報告系統(tǒng)（圖8）。倒置的GFP（Inverted GFP，iGFP）序列插入到CMV啟動子下游，此時GFP不表達。當Cas9對GFP表達盒上下游相距約1.0 kb的位置各產生一個雙鏈切口，iGFP的方向則可能發(fā)生倒轉，使得GFP正常表達。 利用逆轉錄病毒將iGFP整合到鼠3T3細胞染色體中，

構建iGFP單拷貝穩(wěn)定表達細胞系以實現(xiàn)對iGFP重排的量化。FACS分析結果表明，約23.6%±4.1%為GFP+細胞，PCR檢測可見明顯條帶。

該iGFP重排報告系統(tǒng)對研究誘導染色體重排具有一定的應用前景。

現(xiàn)有內源性報告系統(tǒng)中，NHEJ相對于HDR或染色體重排而言，其修復機制更簡單且發(fā)生率更高，對于陽性細胞的富集效率更高。構建穩(wěn)定表達報告系統(tǒng)的細胞系費時費力，但卻具備了外源性報告系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)點，如無需共轉染、可實現(xiàn)報告系統(tǒng)靶標與基因組靶標拷貝數(shù)一致等。然而，由于整合的靶序列難以變更，使得每種構建出的報告細胞系僅能富集對應的目的基因，通用性較差，應用范圍較窄。

5 展 望

目前，外源性游離報告系統(tǒng)雖然存在降解及分布不均一等問題，但其具有設計靈活、轉染便捷等優(yōu)勢，可快速在不同細胞系中應用不同基因編輯工具進行研究;而內源性整合報告系統(tǒng)盡管能夠更加穩(wěn)定地表征基因編輯是否成功，但不可忽略細胞系構建中較長的時間成本。因此外源性報告系統(tǒng)的種類遠多于內源性報告系統(tǒng)。同時，基于常見且高效的NHEJ和SSA機制以及HDR和倒位重排等低效的修復機制，衍生了熒光-熒光、熒光-抗性、熒光-磁性等報告系統(tǒng)。前兩個報告系統(tǒng)的經濟適用性和設計簡便性更高，利用成熟的FACS技術或藥篩法即可進行快速陽性富集。熒光-磁性報告系統(tǒng)更大的意義在于創(chuàng)新性，而昂貴的抗體-磁珠修飾及繁瑣的洗脫步驟則降低了該系統(tǒng)的易用性。盡管上述報告系統(tǒng)實現(xiàn)了快速且高效的富集策略，但客觀存在的內外影響因素，例如細胞系之間的異質性、不同基因位點的識別和靶向效率差異、不同基因編輯工具切割活性差異以及FACS、抗性篩選和磁性分離的靈敏度差異，均可能導致陽性細胞富集倍數(shù)或比例較低的問題。因此，為了最大程度減少或排除陰性及假陽性細胞，達到更高或完全比例的陽性細胞富集目的，可能需要兩種或兩種以上報告系統(tǒng)的共同應用或融合多種富集策略的整合報告系統(tǒng)進行多重篩選富集。另外，此類報告系統(tǒng)還需要細胞毒性試驗以驗證其安全性和穩(wěn)定性，這將有利于確保較高的重復性以及富集后的突變細胞系的下游培養(yǎng)。

未來，基因編輯陽性細胞富集報告系統(tǒng)會不斷完善并聚焦于NHEJ和SSA這兩種高效修復機制。同時，應實時發(fā)展基因編輯工具，例如，重新設計報告載體的序列， 以適用于依賴轉座子的非切割性CRISPR基因編輯系統(tǒng)，或探索其在RNA編輯或單堿基編輯中的應用價值，從而輔助并加速新型基因編輯工具的開發(fā)和拓展報告系統(tǒng)的新用途。此外，還應著力研究可以反映HDR這類具備臨床意義的非錯誤性基因修復的報告系統(tǒng)，以促進精準基因編輯的發(fā)展和應用。

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Abstract Genome editing has become a vital tool in medical biology research. The critical mission of facilitating the progress of genome editing is to enrich positive edited cells quickly and effectively. In recent years， researchers have established various reporter systems for selection and enrichment of editing-induced positive cells based on genome repair mechanisms， such as non-homologous end joining， homology directed repair， single strand annealing and inversion， and the principle of the expression of fluorescent protein or resistance tag after genome repair. The T7E1 assay or sequencing method can analyze the mutation of enriched cells with lower background signals and higher mutation ratio. Therefore， these reporter systems can profit the characterization of genome editing effectiveness. Besides， positive cells can be cultured continuously， so this technology possesses a promising prospect of mutated cell line construction and the research of mutated cell functions. This article summarized the design principles and applications of these reporter systems and provided a reference to construct a more perfect evaluating system for genome editing.

Keywords Genome editing; Repair mechanism; Cell enrichment; Reporter system; Review