韓健利　陳慶輝　鄒美義　路宇　魏明　李成　王承健　黃琳娟　王仲孚

摘 要 雞蛋黃中的唾液酸化糖肽（Sialylglycopeptide，SGP）的肽段部分由6個氨基酸（KVANKT）組成，其中天冬酰胺（N）被唾液酸化的復(fù)雜型N-糖鏈修飾。SGP主要從雞蛋黃中分離獲得，現(xiàn)有的SGP分離純化方法操作繁瑣，成本較高，難以規(guī)?；苽?。本研究基于親水相互作用色譜技術(shù)，用醫(yī)用脫脂棉作為親水色譜柱的固定相，建立了一種從雞蛋黃中分離純化唾液酸化糖肽的方法。首先將雞蛋黃經(jīng)苯酚處理得到唾液酸化糖肽的粗品，然后將糖肽粗品用水配成150 mg/mL的溶液，加入制備好的棉花親水色譜柱中，依次用100%、95%、85%、75%（V/V）的乙腈-水溶液進行除雜，最后用去離子水洗脫唾液酸化糖肽。本方法操作簡單，成本低廉。利用本方法從50個雞蛋黃中制備得到了300 mg SGP，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）鑒定，其純度高達(dá)95%，同時采用電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）對SGP及其糖鏈組成和糖基化位點進行了表征。

關(guān)鍵詞 唾液酸化糖肽; 親水色譜柱; 脫脂棉; 雞蛋黃

1 引 言

糖基化（Glycosylation）修飾是蛋白質(zhì)最普遍、最復(fù)雜的翻譯后修飾之一，目前已知的蛋白質(zhì)中約有一半以上發(fā)生了糖基化修飾[1]。與蛋白共價連接的寡糖鏈在細(xì)胞通訊、細(xì)胞粘附、病原體感染、個體發(fā)育及免疫應(yīng)答等生物過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2～6]。由于糖鏈的生物合成具有結(jié)構(gòu)的微觀不均一性，導(dǎo)致了糖蛋白和糖肽功能上的顯著差異。帶有均一糖鏈的糖蛋白和糖肽是糖鏈結(jié)構(gòu)和功能研究必不可少的材料。開發(fā)制備帶有均一糖鏈的糖蛋白和糖肽的方法成為糖生物學(xué)的研究熱點。

雞蛋黃中唾液酸化糖肽（Sialylglycopeptide， SGP）的肽段部分由6個氨基酸（KVANKT）組成，其中天冬酰胺（N）被唾液酸化的復(fù)雜型N-糖鏈修飾[7～9]。該糖肽是一種人源化的糖肽，研究表明，這種唾液酸化糖肽在許多生物過程中具有重要作用。SGP在腸道疾病的治療過程中具有一定作用，唾液酸化糖肽不僅可抑制沙門氏菌等細(xì)菌感染人類腸道表面細(xì)胞[10]，也可抑制輪狀病毒感染小腸上皮細(xì)胞，對于嬰幼兒腹瀉有較好的治療效果[11]。同時， SGP中唾液酸化的α-（2→6）N-乙酰氨基乳糖殘基在抗流感病毒方面也有重要作用，可作為與A型人流感病毒血凝素結(jié)合的配體，進而阻止病毒感染人體[12]。SGP也可作為糖基供體，用于合成帶有N-糖鏈的親脂類化合物，對藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)具有重要意義[13]。由于唾液酸化糖肽具有重要的生物學(xué)活性和臨床藥用價值，該糖肽的制備和生產(chǎn)顯得尤為必要。

唾液酸化糖肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難用化學(xué)方法或生物工程方法進行合成獲取。SGP是雞蛋黃中的主要成分之一，從雞蛋黃中提取是獲取唾液酸化糖肽的主要途徑。目前主要有兩種純化方法：其一是1997年Seko等[7]首次報道的從雞蛋黃中分離純化唾液酸化糖肽的方法。該方法對雞蛋黃進行苯酚處理后，經(jīng)過兩次Sephadex G-50分離、Sephadex G-25除鹽、DEAE-Toyopeael 650M離子交換柱純化、Sephadex G-25除鹽后，凍干得到樣品，但上述方法具有步驟多、成本高、周期長、樣品損失較大、上樣量少等缺點; 其二是Zou等[14]報道的方法，先用苯酚處理新鮮的雞蛋黃得到唾液酸化糖肽粗提物，再用Sephadex G-50進行分離，最后用活性炭柱進行純化。該方法雖然簡化了一些步驟，但純化周期仍然較長，柱填料成本較高，且由于Sephadex G-50柱層析色譜上樣量的限制，不適合大規(guī)模制備唾液酸化糖肽。

親水相互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography， HILIC）由于能很好地純化分離糖肽[15～17]，在糖組學(xué)和糖蛋白組學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用[18～20]。HILIC固定相的一個重要特征是它們是非離子的，可與糖肽上的糖鏈之間形成氫鍵，從而吸附糖肽，由于低保留率，未被糖基化修飾的肽段、脂質(zhì)、鹽被洗滌劑洗脫[21～23]。Wada等[24]報道了微晶纖維素柱可用于胰蛋白酶糖肽的純化; Sha等[18]將溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化法制備的纖維素微球用于人免疫球蛋白（IgG）糖肽的純化。雖然這些方法都實現(xiàn)了糖肽的純化，但是微晶纖維素柱和合成的纖維素微球填料粒徑小，裝柱時易滲漏; 微晶纖維素柱需使用有強烈的刺激性氣味的正丁醇，而纖維素微球合成產(chǎn)率低且未商品化生產(chǎn)。相比之下，棉花親水色譜柱具有操作簡單、不會滲漏、成本低廉等優(yōu)點。目前尚未有將棉花親水色譜柱用于雞蛋黃中唾液酸化糖肽的規(guī)?；苽涞难芯繄蟮?。

唾液酸化糖肽的肽段部分較短，具有較好的親水性，使得利用棉花親水色譜對其進行分離純化成為可能。本研究以醫(yī)用脫脂棉為HILIC固定相，從雞蛋黃中分離純化SGP，對其結(jié)構(gòu)和純度進行鑒定，純化效果良好。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

LC-2010A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）; LTQ-XL型電噴霧電離質(zhì)譜（美國Thermo Scientific公司）。

N-糖苷酶F（PNGase F， Sigma-Aldrich公司）; 十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS）、二硫蘇糖醇（Dithiothretol， DTT）、NP-40（上海阿拉丁試劑公司）; 乙腈（Acetonitrile， ACN）等試劑均為國產(chǎn)分析純;? WondaSep C18和多孔石墨化碳固相萃取小柱（日本Shimadzu-GL Sciences公司）。醫(yī)用脫脂棉購于西北大學(xué)校醫(yī)院。實驗用水為Milli-Q系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水。新鮮未受精雞蛋購于本地農(nóng)貿(mào)市場。

2.2 實驗方法

2.2.1 雞蛋黃的苯酚預(yù)處理 參考文獻(xiàn)＼[7＼]的方法，用苯酚處理新鮮蛋黃，得到唾液酸化糖肽粗品。首先取50個新鮮未受精的雞蛋蛋黃（約1 L），加入等體積的去離子水稀釋，并攪拌均勻。向上述蛋黃溶液中加入10倍體積的苯酚-水 （1∶9， V/V）溶液，持續(xù)攪拌2 h，然后加入2 L 去離子水，混勻后，以8000 r/min離心30 min，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至50 mL，再經(jīng)冷凍干燥，即得到唾液酸化糖肽粗品，于20℃保存，備用。

2.2.2 棉花親水色譜柱的準(zhǔn)備 取醫(yī)用脫脂棉150 mg均勻塞進1 mL的移液槍槍頭中，并輕微壓實，分別用10 mL水和乙腈清洗棉花柱。

2.2.3 唾液酸化糖肽的富集 將凍干的唾液酸化糖肽粗品配制成150 mg/mL的溶液，12000 r/min離心3 min。取上清液加入清洗好的棉花柱中，用乙腈、乙腈-水 （19∶1， V/V）、乙腈-水 （17∶3， V/V）和乙腈-水 （3∶1， V/V）各15 mL除雜質(zhì)，用6 mL去離子水洗脫唾液酸化糖肽，冷凍干燥，得到唾液酸化糖肽純品，采用ESI-MS進行分析。

2.2.4 唾液酸化糖肽的PNGase F酶解 5 mg樣品溶于50 μL去離子水中，加入等體積的蛋白質(zhì)變性液（0.17 mol/L SDS和0.4 mol/L DTT），100℃加熱變性10 min。冷卻到室溫，向體系中加入60 μL 酶解緩沖液（0.5 mol/L Na3PO4，用H3PO4調(diào)節(jié)至pH 7.5）、60 μL NP-40溶液 （1∶9， V/V）和1.5 μL PNGase F酶（500 units/μL），37℃反應(yīng)24 h [25，26]。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在13000 r/min離心3 min，上清液經(jīng)C18柱和多孔石墨化碳固相萃取小柱純化，用ESI-MS分析。

2.2.5 ESI-MS和MS/MS分析條件 ESI-MS參數(shù)設(shè)置如下：質(zhì)譜進樣口的定量環(huán)為2 μL; 流動相為甲醇-水（1∶1，V/V）; 清洗時流速為200 μL/min; 毛細(xì)管溫度300℃; 進樣檢測時流速為20 μL/min; 離子源電噴霧工作電壓為4 kV; 毛細(xì)管透鏡電壓250 V; 輔助氣（氮氣）流速：鞘氣（氮氣）流速=1∶2（輔助氣體流速一般選擇10 arb）; 毛細(xì)管電壓37 V; 用LTQ Tune軟件對數(shù)據(jù)進行采集。

多級質(zhì)譜（MSn）檢測參數(shù)設(shè)置為：在ESI-MS參數(shù)設(shè)置的基礎(chǔ)上增加了碰撞氣體為氦氣; 狹縫寬度為 m/z 3; 碰撞時的能量選擇30%～45%。

2.2.6 利用HPLC對唾液酸化糖肽進行純度鑒定 對棉花親水色譜柱純化后的唾液酸化糖肽進行高效液相色譜分析，使用酰胺柱HILIC （250 mm×4.6 mm，TSK-GEL Amide-80）。流動相A為乙腈，流動相B為水。將樣品瓶放置在相應(yīng)位置，自動進樣器進樣10 μL。其中分離條件設(shè)置：流速0.8 mL/min; 線性梯度洗脫： 0～60 min，80%～20% A。柱溫為25℃，檢測波長214 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 唾液酸化糖肽的純化策略

雞蛋黃經(jīng)過苯酚處理后得到的唾液酸化糖肽粗提取物中含有大量的雜蛋白、脂質(zhì)和鹽等雜質(zhì)，要得到較純的唾液酸化糖肽，首先須除去上述雜質(zhì)。Seko等[7]報道的純化唾液酸糖肽的方法，主要采用連續(xù)兩次Sephadex G-50純化除去雜蛋白，然后用Sephadex G-25除鹽處理3次，該方法操作繁瑣，由于連續(xù)過柱純化造成了樣品損失嚴(yán)重。 Zou等[14]報道的純化唾液酸糖肽的方法，同樣采取Sephadex G-50除去雜蛋白，然后利用活性炭對唾液酸化糖肽表面糖鏈的吸附作用，將樣品過活性炭柱進行水洗除鹽，該方法相比文獻(xiàn)＼[7＼]方法省略了很多步驟，但由于Sephadex G-50柱層析色譜存在上樣量的限制，而且柱填料成本較高，不利于規(guī)模化制備。 本研究將除雜質(zhì)過程簡化為一步，利用棉花親水色譜柱與糖肽表面糖鏈上的羥基形成次級化學(xué)鍵，體系中的雜蛋白和鹽等雜質(zhì)由于在色譜柱上不能保留而被洗脫除去。分離純化唾液酸化糖肽的策略見圖1，此純化策略具有便捷、高效、柱填料成本低等優(yōu)點，還可對柱體積進行放大處理，實現(xiàn)大規(guī)模純化制備唾液酸化糖肽。

3.2 棉花親水色譜柱純化糖肽過程中洗脫液的ESI-MS圖譜分析

洗脫劑中水的百分比對于親水色譜柱的洗脫效果影響很大，含水量過高將會造成樣品損失。依次用乙腈、乙腈-水（19∶1， V/V）、乙腈-水（17∶3， V/V）和乙腈-水（3∶1， V/V）對棉花親水柱進行洗脫，除去體系中的鹽和蛋白等雜質(zhì)。對洗脫下來的液體進行ESI-MS（負(fù)離子模式下）實時檢測。與圖2A相比，圖2B和圖2C信噪比較差，基線較高，并且未檢測到唾液酸化糖肽的質(zhì)譜信號峰，表明大量雜質(zhì)在乙腈-水（19∶1，V/V）或乙腈-水（17∶3，V/V）的洗脫條件下被洗脫下來。圖2D的基線開始趨于平穩(wěn)，同時有幾條主峰出現(xiàn)， 表明在乙腈-水（3∶1， V/V）的洗脫條件基本接近臨界值。以水對棉花色譜柱進行洗脫，目標(biāo)產(chǎn)物的理論分子量為m/z 2866，由于所用質(zhì)譜儀的檢測分子量上限為2000 Da，在質(zhì)譜檢測中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的雙電荷峰m/z 1431.3＼[M-2H＼]2和三電荷峰m/z 953.9＼[M-3H＼]3，而且信噪比較好（圖2E）。因此，上述結(jié)果表明，利用棉花親水色譜柱可以很好地純化并得到唾液酸化糖肽。

3.3 PNGase F酶處理唾液酸化糖肽后N-糖基化位點的鑒定與糖鏈結(jié)構(gòu)分析

唾液酸化糖肽經(jīng)PNGase F酶解，再通過C18和多孔石墨化碳固相萃取小柱純化后，得到了肽段和糖鏈部分，分別進行ESI-MS分析。圖3為肽段部分的質(zhì)譜圖，唾液酸化糖肽的氨基酸序列為（Lys-Val-Ala-Asn-Lys-Thr），理論分子量為659 Da，經(jīng)PNGase F酶解作用后，天冬酰胺（N）變成天冬氨酸（D），分子量增加0.98 Da，理論分子量變成 660 Da。圖3中的m/z 661質(zhì)譜峰為正離子模式下目標(biāo)肽段的單電荷＼[M+H＼]+峰，與理論分子量相吻合。

為進一步確認(rèn)目標(biāo)峰的氨基酸序列，進行了串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析，結(jié)果如圖4所示，對圖中的b、y離子碎片進行歸屬， 發(fā)現(xiàn)m/z 643.25與肽段的分子量661 Da相差一個水分子，確定其為肽段失去一分子水的碎片峰（M-H2O）; m/z 560.17（b5）為肽段失去一個蘇氨酸殘基質(zhì)量101 Da所形成的碎片峰; m/z 414.17（b4-H2O）為b5失去一個賴氨酸殘基質(zhì)量128 Da和一分子水所形成的碎片峰; m/z 317.25（b3）為b4失去一個天冬氨酸殘基質(zhì)量115 Da所形成的碎片峰，這也符合在PNGase F酶解的過程中，天冬酰胺變成了天冬氨酸; m/z 246.72（b2）為b3失去一個丙氨酸殘基質(zhì)量71 Da而形成的碎片峰; m/z 533.17（y5）為肽段失去一個賴氨酸殘基質(zhì)量128 Da所形成的碎片峰; m/z 434.17（y4）為y5失去一個纈氨酸殘基質(zhì)量99 Da所形成的碎片峰; m/z 363.17（y3）為y4失去一個丙氨酸殘基質(zhì)量71 Da所形成的碎片峰; m/z 248.25（y2）為y3失去一個天冬氨酸殘基質(zhì)量115 Da所形成的碎片峰。結(jié)合上述分析結(jié)果，可以得出肽段的氨基酸序列為KVAN#KT（#表示糖基化位點），與理論序列一致，并確定了序列中的Asn是一個糖基化位點。

在質(zhì)譜的負(fù)離子模式下對糖鏈結(jié)構(gòu)進行解析，結(jié)果如圖5所示，唾液酸糖鏈的理論分子質(zhì)量為m/z 2223， 圖5中的m/z 111109為目標(biāo)糖鏈的雙電荷＼[M-2H＼]2-峰，m/z 222264為其單電荷＼[M-H＼]峰，m/z 224473 為單電荷＼[M+Na-2H＼]峰。為進一步確定糖鏈結(jié)構(gòu)，對圖5中的m/z 224473進行ESI-MS/MS分析，結(jié)果如圖6所示。對圖6中的離子碎片峰進行解析，歸屬如下：m/z 204136是m/z 224473失去一個N-乙酰氨基葡萄糖殘基（203 Da）形成的碎片峰; m/z 202355為m/z 204136失去一分子水形成的碎片峰; m/z 194018（0，2A6）為糖鏈發(fā)生穿環(huán)裂解形成的碎片峰; m/z 183855為m/z 204136失去一個N-乙酰氨基葡萄糖殘基形成的碎片峰; m/z 173255為m/z 202355失去一個唾液酸形成的碎片峰; m/z 158927為m/z 204136失去一個唾液酸和半乳糖殘基形成的碎片峰; m/z 152945為m/z 173255失去一個N-乙酰氨基葡萄糖殘基形成的碎片峰。綜上， 解析出糖鏈結(jié)構(gòu)為H5N4A2（H：己糖; N：N-乙酰氨基葡萄糖; A：唾液酸），與文獻(xiàn)＼[14＼]報道的一致，證明純化得到的產(chǎn)物為唾液酸化糖肽。

通過高效液相色譜（HPLC）對棉花色譜柱純化得到的唾液酸化糖肽進行純度鑒定，色譜圖如圖7所示，在34 min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，對峰面積進行積分，鑒定其純度達(dá)到95%以上。

4 結(jié) 論

采用苯酚對雞蛋黃進行預(yù)處理， 獲取唾液酸糖肽粗品，以脫脂棉制作的親水色譜柱進行除雜，建立了一種操作簡單、快速高效、可大量制備唾液酸化糖肽的方法。 用此方法從50個雞蛋黃中提取到300 mg唾液酸化糖肽，對其進行結(jié)構(gòu)解析和純度鑒定。結(jié)果表明，糖鏈結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、糖基化位點均與理論值相吻合，通過HPLC鑒定其純度>95%。本方法純化唾液酸化糖肽分離步驟少，用時短， 固定相的成本低， 為規(guī)?；苽渫僖核峄请奶峁┝私鉀Q方案，有良好的應(yīng)用前景。

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Abstract The peptide portion of the sialylglycopeptide （SGP） in egg yolk is composed of six amino acids residues （KVANKT）， in which asparagine （N） is modified by sialylated complex N-glycan. SGP is mainly obtained from egg yolk， and currently， the methods for separation and purification of SGP are cumbersome， expensive， and difficult to scale production. In this study， a simple and low-cost method for separation and purification of sialylated glycopeptide from egg yolk was developed based on the hydrophilic interaction chromatography by using medical absorbent cotton as stationary phase. Firstly， 50 egg yolks were treated with phenol to obtain crude sialylated glycopeptide. The obtained glycopeptide was then formulated into a 150 mg/mL solution and loaded onto the prepared cotton hydrophilic chromatographic column， followed by the treatment with 100%， 95%， 85% and 75% acetonitrile aqueous solution to remove the impurity. Finally， the sialyglycopeptide was obtained by eluting with deionized water. By this way， 300 mg SGP was obtained and its purity was identified by high-performance liquid chromatography （HPLC） to be 95%. The glycan composition and glycosylation site of SGP were further validated by electrospray ionization mass spectrometry （ESI-MS） and tandem mass spectrometry （MS/MS）.

Keywords Sialylated glycopeptide; Hydrophilic column; Absorbent cotton; Egg yolk