鄭學(xué)斌 杜 晨 王景倩 詹 煒 謝慶平 樓 寶① 竺俊全①

(1.寧波大學(xué)教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室 寧波 315211；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 杭州 310016)

精子活力是評價精子質(zhì)量的重要指標(biāo),也是精子生理特性研究的主要內(nèi)容(季相山等,2007)。魚類精子活力受鹽度、pH、離子等環(huán)境因子的影響,研究精子活力與環(huán)境因子的關(guān)系,有助于篩選人工授精用激活液及精子冷凍保存用稀釋液(Islamet al,2011；??retmenet al,2016；王鑫偉等,2017)。目前,魚類精子活力及其影響因子的研究已在大黃魚(Larimichthys crocea)(朱冬發(fā)等,2005)、黃姑魚(Nibea albiflora)(閆家強等,2010)、眼斑擬石首魚(Csiaenopso cellatus)(魏平等,2009)、大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)(洪萬樹等,1997)、夏牙鲆(Paralichthys dentatus)(王學(xué)穎等,2016)、真鯛(Pagrosomus major)(江世貴等,2000)、黃鰭鯛(Sparus latus)(黃曉榮等,2008)等海水魚類中研究報道,研究較多的影響因子有鹽度、pH、離子及葡萄糖等。魚類精子活力檢測常用傳統(tǒng)的顯微觀察法,該法主觀性較強,易產(chǎn)生人為誤差,近年來,計算機輔助精子分析系統(tǒng)(Computerassisted sperm analysis,CASA)已在魚類精子活力(運動率、運動速率、鞭打頻率等)的檢測中得到廣泛應(yīng)用,它可避免傳統(tǒng)顯微觀測方法所造成的人為誤差(Kimeet al,2001；劉清華等,2006；季相山等,2007；Kowalskiet al,2019)。

魚類精子的超低溫冷凍保存技術(shù)在人工繁殖、遺傳育種及種質(zhì)資源保存等方面具有重要應(yīng)用價值(Cabritaet al,2010)。目前,已取得精子冷凍保存成功的海水魚類有大黃魚(程順等,2013)、黃姑魚(金春華等,2011)、黑鯛(Sparus macrocephalus)(葉霆等,2009)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)(Chereguiniet al,2003)、鯔魚(Mugil cephalus)(Balamuruganet al,2017)、太平洋鱈(Gadus macrocephalus)(Wanget al,2016)、褐石斑魚(Epinephelus bruneus)(Limet al,2013)等種類。

小黃魚(Larimichthys polyactis)屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬,廣泛分布于渤海、黃海、東海及朝鮮半島西岸海區(qū),曾與大黃魚、曼氏無針烏賊(Sepia maindroni)、帶魚(Trichiurus japonicus)并稱為我國“四大海產(chǎn)”(李建生等,2009)。近年來,小黃魚自然資源因過度捕撈及水環(huán)境污染而衰退,并出現(xiàn)個體小型化、低齡化及性成熟提前等問題(林龍山等,2004；郭旭鵬等,2006；Liuet al,2017),因此,其種質(zhì)資源保護、繁殖生物學(xué)、人工繁殖及增養(yǎng)殖技術(shù)研究引起研究者重視,如性腺發(fā)育(吳佩秋,1981；Limet al,20 10)、精卵發(fā)生(吳佩秋,1980；Kanget al,2013)、精子生理特性(Leet al,2011b)、精子冷凍保存(Leet al,2011a)、人工育苗及養(yǎng)殖(徐獻明等,2014；陳睿毅等,2016)等方面均已見研究報道。但對人工養(yǎng)殖的小黃魚精子活力及超低溫冷凍保存的研究未見報道。本研究檢測分析了養(yǎng)殖小黃魚精子的運動特征及鹽度、pH、離子、葡萄糖等環(huán)境因子的變化對其精子活力的影響；探究了稀釋液、抗凍劑、稀釋比及降溫高度等對精子冷凍保存效果的影響,旨在了解小黃魚精子的生理特性及超低溫冷凍保存效果,為其人工繁殖及種質(zhì)細胞保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人工培育的性成熟小黃魚取自浙江省寧波市象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司,挑選成熟度好的雄魚60尾,體長 13.7±1.13cm,體質(zhì)量 35.38±7.82g。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集 用干毛巾擦凈小黃魚泄殖孔周圍體表水分,輕壓魚腹使精液自然流出,吸取無污物精液于4°C冰盒內(nèi)保存,供后續(xù)實驗。

1.2.2 精子密度測定 取適量精液與HBSS稀釋液以1∶1000比例混勻,滴一滴于血球計數(shù)板(計數(shù)區(qū)16×25格,總體積0.1mm3)上,加蓋玻片后于顯微鏡下觀察并測定精子密度(n=3)。實驗重復(fù)3次,下同。

1.2.3 精子運動特征檢測 取0.5μL精液,加入500μL自然海水激活,并用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)測定激活20s后精子的運動率(percentage of motile,MOT,運動精子占所有精子的百分率)、直線運動速率(straight line velocity,VSL)、曲線運動速率(curvilinear velocity,VCL)、平均路徑運動速率(average path velocity,VAP)、側(cè)擺幅值(amplitude of lateral head displacement,ALH)、鞭打頻率(beating cross frequency,BCF)、平均移動角度(mean angular displacement,MAD)等指標(biāo)(視野數(shù)3,捕捉精子數(shù)≥200),并人工記錄精子的運動時間(moving time,MT)及壽命(life span,LS)(精子激活開始至90%精子原地顫動的時間為運動時間,90%精子停止運動的時間為壽命)。

1.2.4 鹽度對精子活力的影響實驗 在過濾海水(鹽度27,pH 8.1)中添加蒸餾水或海水晶,配制成鹽度為 5、10、15、20、25、30、35、40的實驗溶液,檢測精子在各實驗溶液中的活力(運動率,運動時間及壽命,下同)。

1.2.5 pH對精子活力的影響實驗 在過濾海水(鹽度27,pH 8.1)中滴加1mol/L的HCl或NaOH,配制成 pH 為 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0的實驗溶液,檢測精子在各實驗溶液中活力。

1.2.6 葡萄糖對精子活力的影響實驗 在去離子水中添加葡萄糖,配制成濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L的實驗溶液,檢測精子在各實驗溶液中的活力。

1.2.7 KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液對精子活力的影響實驗 在去離子水中添加NaCl、KCl、MgCl2及CaCl2,配制成濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L的實驗溶液,檢測精子在各實驗溶液中的活力。

1.2.8 不同海水對精子活力的影響實驗 參考魏平等(2009)方法配制全人工海水(每1000mL人工海水中含 19.29g NaCl、4.24g MgSO4、0.84g CaCl2、0.51gKCl、0.12g NaHCO3),并用相同摩爾數(shù)的MgCl2、Na2SO4和NaCl依次替換 ASW中的 CaCl2、MgSO4和NaHCO3,配制成缺Ca2+、缺Mg2+和缺HCO3-的人工海水,檢測精子在各實驗溶液中的活力。

1.2.9 稀釋液種類對冷凍保存效果的影響實驗 分別用 MFRS、ASP、Hank’s、MPRS、HBSS、Cortland為稀釋液(各稀釋液成分見表1),稀釋比1∶3,并添加10%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(終濃度,下同)為抗凍劑,0.25mL麥細管為凍存管,用二步降溫法于液氮面上3.5cm處平衡5min后投入液氮中保存,12h后取出,40°C水浴解凍6s后測定精子活力。

表1 小黃魚精子超低溫冷凍保存稀釋液的組成成分Tab.1 Composition of extender for cryopreservation of L.polyactis sperm

1.2.10 抗凍劑種類及濃度對冷凍保存效果的影響實驗 以HBSS為稀釋液,稀釋比1∶3,分別以5%、10%、15%及20%的DMSO、乙二醇(ethylene glycol,EG)、丙二醇(propyleneglycol,PG)、甘油(glycerol,Gly)作為抗凍劑,0.25mL麥細管為凍存管,用二步降溫法于液氮面上3.5cm處平衡5min后投入液氮中保存,12h后取出,40°C水浴解凍6s后測定精子活力。

1.2.11 稀釋比對冷凍保存效果的影響實驗 以HBSS為稀釋液,分別以1∶1,1∶3,1∶5,1∶7,1∶9稀釋精液,添加10%DMSO為抗凍劑,0.25mL麥細管為凍存管,二步降溫法于液氮面上3.5cm處平衡5min后投入液氮中保存,12h后取出,40°C水浴解凍6s后測定精子活力。

1.2.12 降溫高度對冷凍保存效果的影響實驗 以HBSS為稀釋液,稀釋比1∶3,并添加10%DMSO為抗凍劑,0.25mL麥細管為凍存管,用二步降溫法分別于液氮面上2、3.5、5、7.5、10cm處平衡5min后投入液氮,12h后取出,40°C水浴解凍6s后測定精子活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用Excel和SPSS19.0軟件完成,用Excel進行作圖,用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行顯著性分析(SPSS19.0)。統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 小黃魚精子密度

經(jīng)檢測,小黃魚精液中精子密度為(6.92±1.20)×109/mL。

2.2 小黃魚精子運動特征

小黃魚精子經(jīng)自然海水激活后各運動參數(shù)見表2(n=10),曲線運動速率和平均路徑運動速率較高,直線運動速率較低。

表2 小黃魚精子的運動參數(shù)(n=10)Tab.2 The parameters of sperm movement of L.polyactis(n=10)

2.3 鹽度對小黃魚精子活力的影響

水溫16°C、pH8.1,小黃魚精子在不同鹽度溶液中的活力(運動率、運動時間、壽命)見圖1。精子在鹽度10—40溶液中均有一定比例被激活,在鹽度25—30溶液中,精子運動率大于45%,在鹽度25溶液中,精子運動率、運動時間及壽命分別達(53.43±5.08)%、8.17±0.41min及11.37±0.86min,與對照組無顯著差異。精子在鹽度為5的溶液中未被激活。

圖1 鹽度對小黃魚精子活力的影響Fig.1 Effects of salinity on the motility of L.polyactis sperm

2.4 pH對小黃魚精子活力的影響

水溫16°C、鹽度27,小黃魚精子在不同pH溶液中的活力見圖2。精子在pH 5.0—11.0的實驗溶液中均有一定比例被激活,在pH 7.5—8.5溶液中,精子運動率大于50%,在pH 8.0溶液中,精子運動率、運動時間及壽命分別達(59.12±8.62)%、8.32±0.33min及11.64±0.74min,與對照組無顯著差異。

圖2 pH對小黃魚精子活力的影響Fig.2 Effects of pH value on the motility of L.polyactis sperm

2.5 葡萄糖溶液對小黃魚精子活力的影響

水溫16°C,小黃魚精子在葡萄糖溶液中的活力見圖3。在0.3—1.0mol/L葡萄糖溶液中,均有部分精子被激活,在0.7—0.9mol/L溶液中,精子運動率與對照組無顯著差異,在0.8mol/L溶液中,精子運動率、運動時間及壽命分別達(56.65±5.01)%、8.51±0.46min及12.19±0.67min。在0.1或0.2mol/L葡萄糖溶液中,精子未被激活。

圖3 葡萄糖溶液對小黃魚精子活力的影響Fig.3 Effects of glucose solutions on the motility of L.polyactis sperm

2.6 KCl、NaCl、MgCl2及 CaCl2溶液對小黃魚精子活力的影響

水溫 16°C,小黃魚精子在 KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液中的活力見表3、表4、表5。精子在0.1—0.9mol/L的KCl溶液中均有部分被激活,在0.4或0.5mol/L KCl溶液中,精子的運動率相對較高(約45%),但均顯著低于對照組；在0.1mol/L KCl溶液中,精子未被激活。精子在0.2—1.0mol/L的NaCl溶液中均有一定比例被激活,在0.4—0.6mol/L NaCl溶液中,精子活力較好,在0.5mol/L NaCl溶液中,精子運動率、運動時間及壽命分別達(53.80±12.17)%、7.79±1.45min及10.77±0.88min,與對照組差異不顯著；在0.1mol/L NaCl溶液中,精子未被激活。精子在0.3—1.0mol/L MgCl2溶液中均有一定比例被激活,在0.7—1.0mol/LMgCl2溶液中,精子運動率大于40%,在0.9mol/LMgCl2溶液中,精子運動率、運動時間及壽命分別達(58.39±1.83)%、8.04±0.32min 及 11.71±0.54min,與對照組差異不顯著；在0.1—0.2mol/L MgCl2溶液中,精子未被激活。精子在0.1—0.8mol/L CaCl2溶液中均有部分被激活,在0.2—0.3mol/L CaCl2溶液中,精子運動率,運動時間及壽命相對較高,但均顯著低于對照組；精子在0.9—1.0mol/L CaCl2溶液中未被激活。

2.7 不同海水對小黃魚精子活力的影響

水溫16°C,小黃魚精子在各人工海水及自然海水中的活力見表6。小黃魚精子在自然海水中的運動率顯著高于各人工海水,運動時間及壽命也比各人工海水更長；而在各離子缺陷型人工海水中,精子的運動率與全人工海水相比無顯著差異。

表3 KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對小黃魚精子運動率的影響Tab.3 Effects of KCl,NaCl,MgCl2,CaCl2solutions on the percentage of L.polyactis sperm motile

表4 KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對小黃魚精子運動時間的影響Tab.4 Effects of KCl,NaCl,MgCl2,CaCl2solutions on the moving time of L.polyactis sperm

表5 KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對小黃魚精子壽命的影響Tab.5 Effects of KCl,NaCl,MgCl2,CaCl2solutions on the life span of L.polyactis sperm

表6 不同海水對小黃魚精子活力的影響Tab.6 Effects of different seawater on the motility of L.polyactis sperm

2.8 稀釋液種類對精子冷凍保存效果的影響

以MFRS等6種溶液為稀釋液,10%DMSO為抗凍劑冷凍保存小黃魚精子,結(jié)果顯示,精子在HBSS稀釋液中冷凍保存效果最好,凍精運動率為(41.38±5.03)%,其次是 MFRS,運動率(39.56±6.08)%,在ASP、Hank’s、Cortland及MPRS稀釋液中冷凍保存效果較差。對照組鮮精運動率為(59.93±3.41)%,顯著高于各凍精組(圖4)。

圖4 稀釋液種類對小黃魚精子冷凍保存效果的影響Fig.4 Effects of different extenders on cryopreservation of L.polyactis sperm

2.9 抗凍劑種類及濃度對小黃魚精子冷凍保存效果的影響

以HBSS為稀釋液,不同濃度的四種抗凍劑對精子冷凍保存效果的影響見圖5。10%DMSO及15%PG對精子冷凍保存效果較好,運動率分別為(43.57±2.59)%和(43.06±6.77)%,5%、10%EG,5%、15%、20%DMSO及10%、15%、20%PG保存效果次之,而不同濃度Gly保存效果較差,運動率顯著低于10%DMSO及15%PG。對照組鮮精運動率為(59.27±1.38)%,顯著高于各凍精組(圖5)。

2.10 稀釋比對小黃魚精子冷凍保存效果的影響

以HBSS為稀釋液,10%DMSO為抗凍劑,不同稀釋比冷凍保存小黃魚精子,結(jié)果顯示,精子經(jīng)1∶3或1∶5稀釋后冷凍保存效果較好,運動率分別為(43.59±1.59)%和(42.83±3.72)%,其次為 1∶7,而 1∶1及1∶9冷凍保存效果較差。對照組鮮精運動率為(57.55±2.44)%,顯著高于各凍精組(圖6)。

圖5 抗凍劑種類及濃度對精子冷凍保存效果的影響Fig.5 Effects of different cryoprotectants on cryopreservation of L.polyactis sperm

圖6 稀釋比對小黃魚精子冷凍保存效果的影響Fig 6 Effects of milt/diluent ratios on cryopreservation of L.polyactis sperm

2.11 降溫高度對精子冷凍保存效果的影響

以HBSS為稀釋液,10%DMSO為抗凍劑,不同液氮面高度降溫5min后冷凍保存小黃魚精子,結(jié)果顯示,液氮面3.5cm處降溫5min后冷凍保存效果較好,凍精運動率為(45.67±0.95)%,其次為2cm,而5、7.5或10cm保存效果較差。對照組鮮精運動率為(57.70±2.72)%,顯著高于各凍精組(圖7)。

圖7 降溫高度對小黃魚精子冷凍保存效果的影響Fig 7 Effects of the height above surface of liquid nitrogen on cryopreservation of L.polyactis sperm

3 討論

3.1 精子的運動特征

魚類精子的運動特征因種的不同存在差異,現(xiàn)將部分魚類精子的運動參數(shù)列于表7,對其進行比較。由表7可知,魚類精子的運動速率一般介于幾十至幾百微米每秒,如高體雅羅魚(Siddiqueet al,2016)精子的運動速率約為30μm/s,條紋鋸鮨(韓龍江等,2014)精子的運動速率約為80μm/s,而鯉魚(Cejkoet al,2015)精子的運動速率較高,可達250μm/s以上。本研究中,小黃魚精子的VSL、VCL及VAP分別為11.96±5.21、25.38±7.19及 22.33±6.88μm/s,低于大西洋鱈(Buttset al,2010),歐洲鰻鱺(Gallegoet al,2013)及條紋鋸鮨(Gallegoet al,2013)等海水魚類,而與淡水的高體雅羅魚(Siddiqueet al,2016)相近。研究表明,養(yǎng)殖大西洋鱈精子的運動速率要顯著低于野生大西洋鱈,且兩種環(huán)境條件下,大西洋鱈精子的運動速率均隨繁殖時間的推移呈逐漸上升趨勢(Buttset al,2010),小黃魚精子是否存在此類現(xiàn)象,值得進一步研究。魚類精子的運動軌跡常為光滑的曲線,因此精子VCL和VAP的值基本一致(Rurangwaet al,2004)。表7中,鯉魚(Cejkoet al,2015)、高體雅羅魚(Siddiqueet al,2016)、西伯利亞鱘(Siddiqueet al,2016)、大西洋鱈(Buttset al,2010)等魚的運動速率均以VCL值最大,且VCL和VAP值較接近(表7),表明這些魚類精子多呈曲線式運動。本研究中,小黃魚精子VCL和VAP值也較接近,且VSL較小,表明小黃魚精子的運動方式也是以曲線運動為主。

3.2 環(huán)境因子對精子活力的影響

鹽度是影響海水魚類精子活力的主要因子,且精子適宜的鹽度范圍往往與其生境或繁殖環(huán)境相關(guān)(江世貴等,2000)。據(jù)研究,眼斑擬石首魚(魏平等,2009)、黃姑魚(閆家強等,2010)及大黃魚(朱冬發(fā)等,2005)精子運動適宜的鹽度分別為20—35、25—35及 19.61—24.87,而大彈涂魚(洪萬樹等,1997)精子運動適宜的鹽度范圍較低(15—20)。本研究中,小黃魚精子運動適宜的鹽度為25—30,與黃姑魚(閆家強等,2010)及眼斑擬石首魚(C.ocellatus)(魏平等,2009)精子運動適宜的鹽度相似,小黃魚繁殖期的海區(qū)鹽度一般為27—32,是其精子運動適宜的鹽度范圍。

表7 部分魚類精子運動特征比較Tab.7 Comparison in kinetic characteristics of sperm in some fish species

pH對魚類精子活力影響也較大。據(jù)報道,魚類精漿pH大多介于7.3—8.5之間,多數(shù)魚類精子在中性或偏堿性的水體中激活效果更好(鄧岳松等,1999；Kowalskiet al,2019)。據(jù)研究,大黃魚(朱冬發(fā)等,2005)精子運動適宜的pH范圍是7.5—8.0,精子在pH 7.5溶液中運動率最高、運動時間最長；黃姑魚(閆家強等,2010)精子運動適宜的pH范圍是7.5—8.5,在pH 8.0時,精子活力最好；此外,真鯛(江世貴等,2000)、黃鰭鯛(S.latus)(黃曉榮等,2008)、歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)(??retmenet al,2016)等海水魚類精子也都在中性偏堿的激活液中活力較高。本研究,小黃魚精子運動適宜的pH范圍是7.5—8.5,pH為8.0時,精子運動率、運動時間及壽命分別達(59.12±8.62)%、8.32±0.33min及 11.64±0.74min,表明小黃魚精子也是在偏堿性的環(huán)境中活力較好,因此,在配制小黃魚人工授精激活液或精子冷凍保存抗凍液時,應(yīng)首選pH偏堿性(8.0左右)的配方。

據(jù)報道,適宜濃度的葡萄糖溶液對江鱈(Lota lota)(王位瑩等,2015)、高體雅羅魚(張濤等,2017)、中華鱘(Acipenser sinensis)(劉鑒毅等,2007)及烏原鯉(Procypris mterus)(吳清毅等,2011)等淡水魚類精子活力有促進作用,可延長精子的運動時間或壽命；葡萄糖溶液對眼斑擬石首魚(魏平等,2009)、黃姑魚(閆家強等,2010)、大黃魚(朱冬發(fā)等,2005)等海水魚類精子活力無明顯促進作用,而對夏牙鲆(王學(xué)穎等,2016)精子活力有一定提升。本研究中,小黃魚精子在0.7—0.9mol/L葡萄糖溶液中保持較高活力,在0.8mol/L時,精子運動率、運動時間及壽命分別達(56.65±5.01)%、8.51±0.46min及 12.19±0.67min,但與對照組各活力參數(shù)基本持平,表明葡萄糖對小黃魚精子活力無明顯促進作用。

K+、Na+、Ca2+及Mg2+是激活魚類精子的重要因子,也是精漿中的主要離子成分(Alaviet al,2006；Figueroaet al,2016),不同種魚類精子對各種離子的敏感性不同(Alaviet al,2006),可能會導(dǎo)致其激活適宜的離子濃度有所差異。據(jù)研究,大彈涂魚(魏平等,2010)精子激活效果較好的K+、Na+、Ca2+及Mg2+濃度分別為0.3、0.15、0.1、0.3mol/L,眼斑擬石首魚(魏平等,2009)精子激活效果較好的K+、Na+、Ca2+濃度均為0.6mol/L,而大黃魚(朱冬發(fā)等,2005)精子激活效果較好的K+、Na+濃度分別為0.5和0.3mol/L,本研究小黃魚精子激活效果較好的K+、Na+、Ca2+及Mg2+濃度分別為0.4、0.5、0.2、0.9mol/L,與上述幾種魚類有所不同。

本研究顯示,小黃魚精子在不同離子激活液中的運動率均低于自然海水,這表明單一金屬陽離子對小黃魚精子的激活效果要低于含復(fù)合金屬陽離子的自然海水；小黃魚精子在單一離子缺陷型人工海水和全人工海水中的運動率非常接近(介于48%—53%之間),表明單一離子缺失的人工海水并沒有對其精子活力造成明顯的影響。王學(xué)穎等(2016)研究發(fā)現(xiàn)夏牙鲆精子在自然海水中的運動率要顯著高于各人工海水,自然海水的滲透壓為939mosm/kg,而缺Ca2+、缺Mg2+、缺HCO3-人工海水或全人工海水的滲透壓介于1029—1131mosm/kg之間,因此滲透壓可能是導(dǎo)致精子運動率不同的因素之一。本研究中的小黃魚精子在自然海水中的運動率顯著高于各人工海水,這可能是自然海水與人工海水的離子成分不同及滲透壓不同所致。

3.3 精子超低溫保存的適宜條件

不同種魚類精子超低溫冷凍保存適宜的條件(稀釋液、稀釋比、抗凍劑種類及濃度等)不同(王鑫偉等,2017)。表8是部分海水魚類精子冷凍保存條件及其效果比較。

不同規(guī)格的麥管(0.25、0.5mL)和凍存管(2、5mL)在魚類精子冷凍保存研究中均有應(yīng)用,麥管具有體積小、降溫速率快、穩(wěn)定性高等特點,適用于精液量較少的冷凍保存研究(表8)。而凍存管體積較麥管大、降溫速率相對較慢,適用于精液量較多的冷凍保存研究(Liuet al,2015；Nomuraet al,2018)。本研究的養(yǎng)殖小黃魚雄魚個體較小、精液量較少,因此使用0.25ml麥管進行了冷凍保存研究,以確定其適宜的冷凍條件。今后,若培育較大規(guī)格的小黃魚雄魚,精液量多時,可采用體積較大的凍存管進行精子冷凍保存研究,以便于冷凍保存大量精液。

不同種魚類精子冷凍保存用適宜的稀釋液及其稀釋比不同。Fabbrocini等(2000)和Gwo等(1991)用1%NaCl溶液為稀釋液,分別以1∶6和1∶9的稀釋比冷凍保存金頭鯛及細須石首魚精子效果較好；Chereguini等(2003)用 Mounib’s稀釋液,以 1∶2 的稀釋比冷凍保存大菱鲆精子,獲得與鮮精相近的受精率；Degraaf等(2004)調(diào)整了 Mounib’s稀釋液成分,并以1∶3的稀釋比冷凍保存條紋鋸鮨精子,獲得與鮮精相近的運動率和受精率。此外,HBSS、Hank’s、Ranger、Cortland等稀釋液在庸鰈、夏牙鲆、紫紅笛鯛、大黃魚等海水魚類精子冷凍保存研究中獲得較好的效果(表8)。本研究,以10%DMSO為抗凍劑,以HBSS為稀釋液、1∶3或1∶5的稀釋比,超低溫冷凍保存小黃魚精子,獲得了較好的運動率,但與鮮精運動率相比仍有一定差距。

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超低溫冷凍過程會導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)損傷,適宜濃度的抗凍劑可有效保護精子結(jié)構(gòu)(陳松林等,1992；Kowalskiet al,2019)。DMSO、Gly、EG、PG等是魚類精子冷凍保存常用的抗凍劑,其中DMSO具有滲透速度快、分布均勻、毒性低等特點(李純等,2000),在庸鰈、金頭鯛、細須石首魚等海水魚類精子冷凍保存中起到較好的抗凍保護效果(表8)?？箖鰟┻m宜的使用濃度一般在5%—20%之間(表8)。本研究的小黃魚精子冷凍保存采用10%DMSO及15%PG為抗凍劑,凍精解凍后運動率分別為(43.57±2.59)%和(43.06±6.77)%,與鮮精運動率(57.70±2.72)%較為接近,表明10%DMSO和15%PG適用于小黃魚精子超低溫冷凍保存。

精子冷凍保存的降溫方法主要有液氮面高度降溫法或程序降溫法,兩者使用的儀器設(shè)備和操作方法有所不同,但都是控制降溫速率。由表8可知,使用程序降溫法超低溫凍存魚類精子,其適宜的降溫速率因魚的種類不同存在差異,但多數(shù)在10—20°C/min；少數(shù)魚如綠鰭馬面鲀降溫速率較高(40°C/min)。使用液氮面高度降溫法超低溫凍存魚類精子,多數(shù)在液氮面3—5cm處降溫3—5min后投入液氮保存。液氮面3.5cm處的溫度約-76°C(Limet al,2013),如果在此高度降溫5min,平均降溫速率為15.2°C/min。本研究的小黃魚精子冷凍保存也是在液氮面3.5cm處平衡5min后投入液氮,其降溫速率在15°C/min左右。今后,應(yīng)開展程序降溫法超低溫凍存小黃魚精子試驗,以確定其最佳降溫速率,提高凍存效果。

4 結(jié)論

小黃魚精子主要以曲線運動為主,精子適宜的鹽度為25—30,適宜的pH為7.5—8.5,適宜濃度的葡萄糖溶液對精子活力無明顯促進作用。小黃魚精子在KCl和CaCl2溶液中受到一定程度抑制,活力明顯低于對照組。單一離子缺陷型人工海水對小黃魚精子活力影響不大,但激活效果不及自然海水。小黃魚精子經(jīng)HBSS稀釋液1∶3稀釋,添加10%DMSO及15%PG為抗凍劑,液氮面3.5cm處降溫5min后投入液氮保存效果較好,凍精運動率與鮮精較接近。