樊博琳 潘麗霞 王忠良 黎 源 簡(jiǎn)紀(jì)常,3,4 王 蓓,3,4①

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湛江 524088；2.廣西科學(xué)院 南寧 536000；3.中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 青島266071；4.海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一類致病性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,又被稱為B群鏈球菌(group BStreptococcus,GBS)。能引起人類敗血癥、腦膜炎等疾病及多種動(dòng)物鏈球菌病(Pereiraet al,2010),也是近年引起羅非魚(yú)鏈球菌病的主要病原菌。無(wú)乳鏈球菌誘發(fā)的羅非魚(yú)發(fā)病率和死亡率極高,發(fā)病率一般達(dá)20%—30%,發(fā)病魚(yú)死亡率達(dá)95%以上,嚴(yán)重影響了我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益(盧邁新等,2010)。

AI-2信號(hào)分子受體(呋喃酰硼酸二酯受體,Furanosyl borate diester receptor)在細(xì)菌識(shí)別和感知周圍環(huán)境變化,并做出適應(yīng)性反應(yīng)(細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng),Quor-um sensing,QS)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用(Bassleret al,2006；馬艷平等,2013)。迄今為止,研究者們已從遺傳學(xué)、生物化學(xué)和生物信息學(xué)三個(gè)層面鑒定出了兩種AI-2特異性表面結(jié)合受體(Chenet al,2002；Milleret al,2004),分別為 LuxP蛋白和 LsrB蛋白(Pereiraet al,2013)。然而,研究發(fā)現(xiàn)并不是所有細(xì)菌均存在以上兩類受體蛋白。那么在其他種類的細(xì)菌中,由誰(shuí)來(lái)?yè)?dān)當(dāng)AI-2信號(hào)分子受體呢？近年來(lái),科學(xué)家們展開(kāi)了一系列研究,Armbruster等(2010)在分析伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitan)和流感嗜血桿菌(Haemophilusin fluenzae)全基因組序列時(shí),發(fā)現(xiàn)了一種被稱作核糖結(jié)合蛋白B(Ribose binding protein B,RbsB)的可溶性細(xì)胞周質(zhì)蛋白家族成員,它們與大腸桿菌(Escherichia coli)LsrB蛋白的核酸和氨基酸序列同源性分別達(dá)到了86%和76%,且與LsrB蛋白一樣,具有由L-S-G-G-Q氨基酸殘基組成的高親和力蛋白特征性模Walker C(Armbrusteret al,2010)。Armbruster及其團(tuán)隊(duì)通過(guò)體外人工補(bǔ)充AI-2分子,構(gòu)建luxS和rbsB基因缺失株,獲得了流感嗜血桿菌生物膜形成表型的正負(fù)反饋調(diào)控的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。綜上所述,推測(cè)RbsB可能是一種新型的細(xì)菌 AI-2信號(hào)分子受體,并在AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)中單獨(dú)或與LsrB和LuxP經(jīng)典受體共同發(fā)揮作用(Armbrusteret al,2009,2010,2011)。

研究AI-2信號(hào)分子介導(dǎo)的細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)于了解無(wú)乳鏈球菌毒力因子調(diào)控、生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及抗藥性產(chǎn)生等生物學(xué)效應(yīng)具有重要的意義,也是尋找新型藥物靶標(biāo)的重要理論基礎(chǔ)(馬艷平等,2013)。本研究以期獲得無(wú)乳鏈球菌RbsB具有AI-2信號(hào)受體功能的可靠證據(jù),并開(kāi)展對(duì)RbsB的AI-2分子受體功能分析及作用機(jī)制研究,旨在為開(kāi)發(fā)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的新型抗菌候選藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)毒株(S.agalactiae)ZQ 0910(中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏編號(hào)為CGMCC 7.264)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；大腸桿菌表達(dá)菌株 BL 21(DE3)與pGEX-6P-1載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XhoI,克隆載體pMD18-T,ExTaq DNA聚合酶,T4 Ligase購(gòu)買自寶生物工程有限公司(大連)；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和PierceTMHRV 3C Protease Solution Kit購(gòu)買自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司；引物、氨芐青霉素(Ampicillin)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)買自生工生物工程有限公司(廣州)；考馬斯亮藍(lán)快速染液購(gòu)買自全式金生物技術(shù)有限公司(北京),NeXtal Tubes JCSG Core Suite I,II,III,IV為德國(guó)QIAGEN產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取細(xì)菌基因組DNA及擴(kuò)增RbsB基因 提取無(wú)乳鏈球菌基因組DNA,根據(jù)GenBank上已登錄的RbsB基因序列(GenBankAccession：AP018935.1)設(shè)計(jì)特異性引物RbsBF/RbsBR,引入酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI,引物由生工生物工程(廣州)有限公司合成。

反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 5min,94°C 30s,60°C 30s,72°C 90s,共30個(gè)循環(huán),72°C再延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后再切膠回收,連接入pMD18-T載體,菌落PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆送生工生物工程股份有限公司(廣州)測(cè)序。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒載體及誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化回收后用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收后定向插入經(jīng)BamHI和XhoI內(nèi)切酶雙酶切的pGEX-6P-1質(zhì)粒載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-RbsB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于Amp+的LB瓊脂平板,37°C條件下培養(yǎng)12h,從平板挑取單菌落于Amp+的LB液體培養(yǎng)基中,37°C、220r/min培養(yǎng)1h,提取重組質(zhì)粒送至測(cè)序(廣州生工)測(cè)序正確后,進(jìn)行菌落PCR鑒定和雙酶切檢測(cè),檢測(cè)正確后接種于新鮮的Amp+的 LB液體培養(yǎng)基(比例 1∶100)中,37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng),至 OD600值達(dá)到0.6—0.8,加IPTG(終濃度為0.2mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3 重組融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 將鑒定正確的表達(dá)菌接種到 2mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中,加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(終濃度為0.2mmol/L),選擇16°C、30°C、37°C 三個(gè)溫度條件下 220r/min 振蕩培養(yǎng)4h后離心收集菌體沉淀。經(jīng)超聲波破碎離心后分別取樣品上清液和菌體沉淀(溶于尿素中)并進(jìn)行3個(gè)相同條件的重復(fù)組,用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達(dá)的最佳條件。

1.2.4 RbsB蛋白純化及鑒定 大量表達(dá)pGEX-6P-1-RbsB重組融合蛋白,離心收集菌體沉淀后用Equilibration Buffer(50mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,10%glycerol pH 8.0)溶液混懸,超聲波破碎并高速離心制備菌體上清。取3mL谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂(Glutathione Sepharose 4B)加入到5mL層析柱中,層析柱與DH電腦恒流泵和HUXI紫外檢測(cè)儀連接。使用50mL GST Equilibration Buffer平衡層析柱30min,加入制備好的菌體上清,使菌體上清與谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂靜置結(jié)合30min,使用GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,15mmol/L reduced glutathione pH 8.0)洗脫液進(jìn)行洗脫,根據(jù)紫外顯示儀數(shù)字變化(波長(zhǎng)為A280nm)收集洗脫液,收集原始菌體上清液,流穿液,洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 切除融合表達(dá)蛋白GST標(biāo)簽 使用超濾濃縮管(Milipore)(10kDa)濃縮收集到的蛋白洗脫液后,用PierceTMHRV 3C Protease Solution Kit試劑盒進(jìn)行切除GST標(biāo)簽,純化后的重組蛋白2900μL中加入HRV 3C Protease 100μL,4°C 冷藏過(guò)夜。用 AKTATMpurifier全自動(dòng)層析儀根據(jù)分子量大小不同分離GST標(biāo)簽與Rbsb蛋白,收集洗脫峰對(duì)應(yīng)樣品,用SDSPAGE進(jìn)行檢測(cè)并采用蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.6RbsB基因序列分析 通過(guò)使用DNAMAN程序獲得RbsB推導(dǎo)氨基酸序列；使用ExPASy(http：//expasy.org/tools/)網(wǎng)址進(jìn)行RbsB蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；使用Softberry程序?qū)Π被峁δ芪稽c(diǎn)進(jìn)行分析；使用signalIP4.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽位置及剪切位點(diǎn)；使 用 InterProScan 程 序(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；使用(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)網(wǎng)址進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并通過(guò)圓二色譜實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證(實(shí)驗(yàn)在持續(xù)氮?dú)饬鞯淖饔孟?對(duì)樣品的圓二色譜變化進(jìn)行測(cè)定,掃描波長(zhǎng)范圍在200—260nm之間,比色皿的光程為0.5cm,掃描速度為50nm/min,進(jìn)行3次重復(fù)掃描)；使用SWISS-MODEL在線軟件(http：//www.expasy.org/)對(duì)RbsB蛋白3D三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.7 RbsB蛋白的結(jié)晶條件篩選 將RbsB蛋白分別濃縮到10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL,利用NeXtal Tubes JCSG Core Suite(I,II,III,IV)蛋白結(jié)晶條件篩選試劑盒,共384個(gè)結(jié)晶條件。對(duì)RbsB蛋白通過(guò)坐滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行結(jié)晶條件的初步篩選,將RbsB蛋白溶液與池液在晶體板的樣品槽內(nèi)1∶1等比例混合,用封膜密封,置于16°C恒溫室中,每3天通過(guò)顯微鏡觀察蛋白液滴內(nèi)晶體的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增 RbsB基因片段以及構(gòu)建可溶性表達(dá)載體

以無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板,用帶酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增后,獲得一大小約為 969bp的目的條帶(圖1),與預(yù)期相符。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切,圖2中泳道片段大小分別約為5000bp和969bp,測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 RbsB蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

從圖3中可以看出,在保證其他實(shí)驗(yàn)條件相同情況下,不同溫度誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)量和可溶性分析表明37°C條件下RbsB全菌蛋白表達(dá)量高于16°C和30°C的表達(dá)量；在沉淀中的融合蛋白表達(dá)量顯著低于在上清中的表達(dá)量。進(jìn)行3個(gè)重復(fù)組結(jié)果均一致,故該融合蛋白最佳誘導(dǎo)溫度是37°C,并選擇在上清中進(jìn)行純化。

圖1 無(wú)乳鏈球菌RbsB基因的克隆Fig.1 Cloning of RbsB gene from S.agalactiae

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-RbsB的酶切鑒定Fig.2 The result of pGEX-6p-1-RbsB digested by BamHI and XhoI

2.3 RbsB蛋白的純化及鑒定

將pGEX-6P-1-RbsB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)優(yōu)化條件(0.2mmol/L IPTG,4h,37°C)誘導(dǎo)后,根據(jù)紫外顯示儀數(shù)字變化在第二個(gè)峰值處(波長(zhǎng)為A280nm)收集洗脫液(圖4)。分別取上清液、流穿液、洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)純化后可以得到含量較高的融合蛋白(10.464mg/mL),且在59ku處有一條明顯蛋白條帶(圖5),與預(yù)期相符。

2.4 切除融合蛋白GST標(biāo)簽

將收集到的洗脫液濃縮至3mL,用試劑盒進(jìn)行切除GST標(biāo)簽工作,經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂(Glutathione Sepharose 4B)純化后收集3管洗脫液,分別與HRV 3C Protease過(guò)夜反應(yīng),SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,本研究成功將GST標(biāo)簽從融合蛋白成除,分別得到GST標(biāo)簽蛋白(26ku)和RbsB蛋白(33ku)。

圖3 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of the Rbsb fusion protein at different temperatures

圖4 紫外吸收?qǐng)D譜Fig.4 The ultraviolet absorption spectrum

圖5 重組蛋白GST-RbsB純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GST-RbsB

2.5 分子篩分離RbsB蛋白

將收集到的3管融合蛋白與HRV 3C Protease過(guò)夜反應(yīng)上清濃縮至2mL,使用AKTATMpurifier全自動(dòng)層析儀,根據(jù)分子量大小不同徹底分離GST-tag與RbsB蛋白,根據(jù)全自動(dòng)層析儀電腦操作頁(yè)面數(shù)據(jù)變化顯示,選取峰值處10管進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示第1—6管為RbsB蛋白(33ku),第7—10管為GST-tag(26ku)與融合蛋白(59ku)混合液,分子量大小正確(圖7)。

圖6 GST-Rbsb融合蛋白純化及切除GST標(biāo)簽Fig.6 Purity of GST-Rbsb fusion protein excision of GST-tag

2.6 RbsB基因序列分析

RbsB基因(GenBank Accession：AP018935.1)全長(zhǎng)969bp,可編碼322個(gè)氨基酸,ProtParam分析RbsB推導(dǎo)氨基酸序列,RbsB蛋白理論分子量33.9ku,等電點(diǎn)為9.41,其中丙氨酸(Ala)含量最高為13.4%,賴氨酸(Lys)其次為11.8%。其中帶正電荷的氨基酸有42個(gè),帶負(fù)電荷的氨基酸有31個(gè)。SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)該序列功能位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)該序列有N-糖基化位點(diǎn)4個(gè),cAMP-和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)1個(gè),蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)5個(gè),酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)2個(gè),N-豆蔻?；稽c(diǎn)8個(gè),酰胺化位點(diǎn)3個(gè),原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著部位1個(gè),微生物C末端靶向信號(hào)7個(gè)。signalIP4.0預(yù)測(cè)RbsB存在信號(hào)肽,1—24為信號(hào)肽區(qū)域,其中信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在24—25氨基酸之間。

圖7 使用AKTATMpurifier切除GST標(biāo)簽后RbsB蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of single RbsB protein using AKTATMpurifier

2.7 RbsB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

分析RbsB的二級(jí)結(jié)構(gòu),從RbsB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖(圖9)中可以看出RbsB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有：α-螺旋(46.27%)、無(wú)規(guī)卷曲(38.15%)、β-折疊(15.22%)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況可以用圓二色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明,已知α-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰,在190nm附近有一正峰。結(jié)果顯示所測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有明顯的α螺旋結(jié)構(gòu)且所占比重最高,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.8 RbsB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用InterProScan程序分析預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域得在氨基酸50—300間有一結(jié)構(gòu)域,為周質(zhì)結(jié)合蛋白區(qū)域。采用在線SWISS-MODEL程序?qū)bsB蛋白同源建模,建模結(jié)果如圖11所示,其中三維圖是以2joy.1.A為模版,分別利用無(wú)乳鏈球菌ZQ0910菌株RbsB和大腸桿菌核糖結(jié)合蛋白A氨基酸序列49—318區(qū)域構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu),相似性達(dá)到47.78%。

2.9 RbsB蛋白結(jié)晶條件初篩

通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒NeXtal Tubes JCSG Core(I,II,III,IV)共計(jì)384個(gè)條件對(duì)RbsB蛋白進(jìn)行了結(jié)晶條件的初步篩選。如圖12所示,在NeXtal Tubes JCSG Core Suite III(0.2mol/L di-Potassium hydrogen phosphate,20%(W/V)PEG3350)和NeXtal TubesJCSG CoreSuite IV(1.5mol/L ammonium sulfate,25%(V/V)Glycerol)條件下有晶體長(zhǎng)出,該晶體呈棱柱狀較為規(guī)整,對(duì)應(yīng)于圖12中a、b,提示有希望進(jìn)一步優(yōu)化獲得可衍射的晶體。

3 討論

尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)不但肉質(zhì)鮮嫩,而且具有生長(zhǎng)快、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),受到了國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖戶的青睞。但是近年隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖環(huán)境的持續(xù)惡化,鏈球菌病的大規(guī)模暴發(fā),嚴(yán)重影響了我國(guó)國(guó)內(nèi)尼羅羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(張新艷等,2008；黃錦爐,2012)。羅非魚(yú)鏈球菌病(Streptococcosis)具有高溫好發(fā)、傳染性高和死亡率高的特點(diǎn),其從屬于細(xì)菌性疾病。在世界范圍內(nèi)其病原主要為無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)和海豚鏈球菌(S.iniae),無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)是我國(guó)南方地區(qū)鏈球菌病的主要病原菌(王蓓等,2013)。研究AI-2信號(hào)分子介導(dǎo)的細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)于了解無(wú)乳鏈球菌毒力因子調(diào)控、生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及抗藥性產(chǎn)生等生物學(xué)效應(yīng)具有重要意義。本研究將對(duì)探索RbsB分子作為“第3類”AI-2信號(hào)分子受體提供直接證據(jù)。

獲得晶體的前提條件是得到純度好、濃度高的可溶性蛋白,因此在表達(dá)載體和表達(dá)菌株的選擇上,我們采用了可溶表達(dá)性更高的pGEX-6P-1載體,并采用大腸桿菌BL21作為表達(dá)菌株。pGEX-6P-1表達(dá)載體自帶 GST融合標(biāo)簽,具有一定的溶解度在大腸桿菌中,同時(shí)還參與了體系中二硫鍵還原等過(guò)程,為后續(xù)蛋白質(zhì)的純化與鑒定提供了方便(Mainaet al,1988；Sharrocks,1994)。重組蛋白用大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)有兩種形式；一種表達(dá)形式是以包涵體出現(xiàn),另外一種是可溶性表達(dá),即重組蛋白存在于上清中。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3組重復(fù)試驗(yàn)均顯示在上清中表達(dá)量明顯高于在包涵體中的表達(dá)量,故實(shí)驗(yàn)選擇在上清中表達(dá)利于后續(xù)蛋白純化工作,獲得有活性的RbsB蛋白。

圖8 RbsB基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列和功能位點(diǎn)Fig.8 Open reading frame and deduced amino acid sequences of RbsB gene

重組融合蛋白的表達(dá)水平不僅與宿主和表達(dá)載體有關(guān),也和誘導(dǎo)條件有著密切的關(guān)系(Sharrocks,1994)。其中一個(gè)重要的影響條件是誘導(dǎo)溫度,在誘導(dǎo)過(guò)程中溫度會(huì)影響氧的溶解度快慢、并對(duì)酶的反應(yīng)速率造成加快或減慢,進(jìn)而影響蛋白的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)固定其他因子,對(duì)單個(gè)因子溫度進(jìn)行16°C、30°C、37°C三個(gè)條件進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證37°C表達(dá)量最佳。為了降低誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)大腸桿菌代謝的毒性作用,用終濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)時(shí)間為4h,用Glutathione Sepharose 4B親和樹(shù)脂純化重組蛋白,結(jié)果測(cè)得在上清中取得了10.464mg/mL較高的重組蛋白表達(dá)量。使用PierceTMHRV 3C Protease切掉GST-tag然后經(jīng)AKTATMpurifier全自動(dòng)層析儀按分子量大小將Rbsb蛋白與GST-tag分離開(kāi)。SDS-PAGE檢測(cè)表觀徹底將RbsB蛋白與GST-tag分離開(kāi),成功獲取到純度很高的RbsB蛋白。

圖9 無(wú)乳鏈球菌RbsB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Predicted secondary structure of RbsB protein

圖10 圓二色譜測(cè)RbsB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.10 Determination of secondary structure of RbsB protein by circular dichroism

圖11 無(wú)乳鏈球菌RbsB蛋白(a)與大腸桿菌周質(zhì)糖結(jié)合蛋白A(b)蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.11 Three-dimensional structure prediction

圖12 RbsB蛋白結(jié)晶體Fig.12 The crystallization of RbsB protein

生物信息學(xué)是研究基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的重要工具,是一門(mén)檢索、儲(chǔ)存并分析生物信息的科學(xué),它將信息技術(shù)應(yīng)用到了生命科學(xué)領(lǐng)域。本研究對(duì)RbsB蛋白進(jìn)行了一系列基因序列分析包括；蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；氨基酸功能位點(diǎn)進(jìn)行分析；預(yù)測(cè)信號(hào)肽位置及剪切位點(diǎn)；預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域；進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白3D三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等工作。通過(guò)氨基酸功能位點(diǎn)分析可知蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)5個(gè),N-豆蔻?；稽c(diǎn)8個(gè)以及微生物C末端靶向信號(hào)7個(gè)(數(shù)量最多)蛋白激酶C能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子,能激活細(xì)胞質(zhì)中的靶酶參與生化反應(yīng)的調(diào)控,參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)的基因表達(dá)的調(diào)控(周小東等,2013)；而N-豆蔻?；稽c(diǎn)和微生物C末端靶向信號(hào)位點(diǎn)也在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用,更為驗(yàn)證了RbsB可能是一種新型的細(xì)菌AI-2信號(hào)分子受體,并在AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)中單獨(dú)或與LsrB和LuxP經(jīng)典受體共同發(fā)揮作用這一推測(cè)。通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和圓二色譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α螺旋結(jié)構(gòu)所占比重最高,而α螺旋結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)構(gòu)象中最穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu),不論是長(zhǎng)鏈還是短鏈,也不論α螺旋相互作用是強(qiáng)還是弱,一旦螺旋結(jié)構(gòu)形成,在拉伸過(guò)程中都能保持α螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,這無(wú)疑為后續(xù)蛋白晶體優(yōu)化實(shí)驗(yàn)提供了保證。

20世紀(jì)70年代初期,中國(guó)科學(xué)工作者測(cè)定了亞洲地區(qū)第一個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)-豬胰島素三方二鋅晶體結(jié)構(gòu),成為中國(guó)結(jié)構(gòu)生物學(xué)歷史發(fā)展的起點(diǎn),進(jìn)入新世紀(jì)后該學(xué)科更是展現(xiàn)出快速發(fā)展姿態(tài)(王大成,2014)。本研究利用蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒NeXtal Tubes JCSG Core(I,II,III,IV)共計(jì)384個(gè)條件篩選出了兩個(gè)可形成柱狀晶體的條件,從結(jié)晶篩選條件和晶體外觀可判斷出這些晶體應(yīng)為蛋白晶體,說(shuō)明RbsB蛋白具備可結(jié)晶性。柱狀蛋白晶體相比較針狀蛋白晶體來(lái)說(shuō),其通常衍射能力較強(qiáng),可以滿足后期收集較高分辨率數(shù)據(jù)的需要。對(duì)于單顆晶體,我們也經(jīng)?？梢詫?duì)采用多點(diǎn)收集以及螺旋收集(helical collection)的方法來(lái)獲得更好的數(shù)據(jù)質(zhì)量與分辨率(閆創(chuàng)業(yè),2014)。為了能夠得到良好的衍射數(shù)據(jù),我們擬在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,以上述篩選到的結(jié)晶條件為基礎(chǔ),繼續(xù)優(yōu)化結(jié)晶條件,以提升獲得可用于衍射數(shù)據(jù)收集的高質(zhì)量RbsB晶體的概率,關(guān)于RbsB蛋白晶體,我們將從功能位點(diǎn)進(jìn)行分析并輔以細(xì)菌表型的研究從而確認(rèn)其受體功能,旨在為尋找新型藥物靶標(biāo)的重要理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆RbsB基因,該基因全長(zhǎng)969堿基,編碼322個(gè)氨基酸,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)所占比重最高,RbsB蛋白理論分子量33.9ku,篩選到RbsB蛋白的初始結(jié)晶條件為：0.2mol/L di-Potassium hydrogen phosphate,20%(W/V)PEG3350；1.5mol/L ammonium sulfate,25%(V/V)Glycerol),獲得RbsB蛋白結(jié)晶體。本研究結(jié)果可為無(wú)乳鏈球菌核糖結(jié)合蛋白(RbsB)的功能解析提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ),將從功能位點(diǎn)進(jìn)行分析并輔以細(xì)菌表型的研究從而確認(rèn)其受體功能,旨在為尋找新型藥物靶標(biāo)的重要理論基礎(chǔ)。