林謙 章慶華 付承林 夏青青 王瓊英

泛素樣含PHD和環(huán)指域蛋白1（UHRF1）是新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的核蛋白基因，屬UHRF家族成員之一，是首先被克隆作為一種與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的核蛋白基因［1］。其是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，參與并維持DNA的甲基化。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)其在靜止的細(xì)胞中表達(dá)較低，而在增殖的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，是一個(gè)致癌基因［2］，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)。本研究采用免疫熒光的方法，測(cè)定膀胱癌組織及癌旁正常組織中UHRF1的表達(dá)情況，并探討其與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料選取2016年1月至2018年6月本院膀胱癌手術(shù)患者82例（經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切62例、膀胱部分切除2例、根治性膀胱全切18例），所有患者均為初次手術(shù)，術(shù)前未接受任何局部及全身放化療。男62例，女20例；年齡39~84歲，平均年齡63.2歲。標(biāo)本經(jīng)病理確診為膀胱癌，其中尿路上皮癌77例，非尿路上皮癌5例（鱗癌3例，腺癌2例）。同期取距離腫瘤邊緣至少>2cm癌旁正常膀胱組織56個(gè)病例樣本作為對(duì)照。標(biāo)本均在手術(shù)切除后30min內(nèi)完成采集。分別記錄年齡、性別、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、是否肌層浸潤(rùn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑鼠抗人UHRF1抗體，abcam公司，貨號(hào)ab57083，規(guī)格100μg，購(gòu)自匠萊生物科技（上海）有限公司。

1.3 免疫熒光方法病理標(biāo)本常規(guī)石蠟切片，水化后置于二甲苯（I）1h，二甲苯（II）1h，二甲苯：酒精1∶110min，100%酒 精（I）1min，100%酒 精（II）1min，90%酒精1min，80%酒精1min，70%酒精1.5min，50%酒精1.5min，單蒸水中浸泡>2min，2h以內(nèi)。37°胃蛋白酶修復(fù)30min，PBS洗3次。1%BSA室溫封閉2h。UHRF1抗體用一抗稀釋液稀釋200x，4°濕盒孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照組用1%BSA代替。回收抗體，PBS水洗3次，5min/次。Anti-mouse-546熒光二抗用1%BSA稀釋200x，常溫孵育2h?；厥湛贵w，PBS水洗3次，5min/次。1000x稀釋的DAPI染色15min，PBS水洗3次。防淬滅封片劑10μl滴在每個(gè)樣本上，小圓玻片覆蓋其上。全程濕盒里操作，結(jié)束后濕盒避光4°放置，1周內(nèi)置熒光顯微鏡下拍照。

1.4 結(jié)果判斷熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)熒光顯影為UHRF1表達(dá)陽(yáng)性，無(wú)熒光顯影為UHRF1表達(dá)陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。比較UHRF1在膀胱癌組織與癌旁正常組織間的表達(dá)差異；分別比較各臨床病例特征（年齡、性別、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、是否肌層浸潤(rùn)）UHFR1表達(dá)情況的差異。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UHFR1在癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)82例膀胱癌組織中，UHRF1表達(dá)的陽(yáng)性率為78.0%（64/82），56例癌旁正常膀胱組織中表達(dá)率為10.7%（6/56）。兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 癌旁正常組織中，未見(jiàn)UHRF1表達(dá)

圖2 癌組織中見(jiàn)UHRF1陽(yáng)性表達(dá)

2.2 UHFR1的表達(dá)與臨床特征關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 UHRF1在膀胱癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

3 討論

膀胱癌是我國(guó)泌尿生殖系腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤，男女發(fā)生率大約3∶1，好發(fā)年齡50~70歲，特點(diǎn)是易復(fù)發(fā)、進(jìn)展，嚴(yán)重危害中老年人的健康。UHRF1基因是一種DNA甲基化蛋白，是維持DNA甲基化和組蛋白編碼的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)其在多種癌癥組織如胃癌、前列腺癌、肺癌、宮頸癌及乳腺癌等中均存在過(guò)表達(dá)［3-6］。UHRF1可以破壞表觀遺傳密碼，其表達(dá)水平的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展、細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移［7］。

本資料結(jié)果表明，相比癌旁正常組織，膀胱癌組織中UHFR1的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。同時(shí)，對(duì)臨床病理特征（年齡、性別、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、是否肌層浸潤(rùn)）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在年齡、性別、組織學(xué)類型方面，UHRF1的表達(dá)并無(wú)差異，但在有關(guān)腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)組織學(xué)分級(jí)、分期、浸潤(rùn)程度上，UHRF1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高級(jí)別、臨床分期較高、肌層浸潤(rùn)，均是膀胱癌進(jìn)展和預(yù)后不佳的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。UHRF1促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制較為復(fù)雜，目前較為明確的是其通過(guò)腫瘤抑制基因如BRCA1、CDKN2A、p73和RASSF1的高甲基化引起癌細(xì)胞活化，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［8］。KISS1被廣泛認(rèn)為能抑制各種癌癥的轉(zhuǎn)移，是一種抑癌基因，目前有研究表明其在膀胱癌中受到高甲基化的表觀遺傳學(xué)抑制［9］。過(guò)度表達(dá)的UHRF1可能增加CPG核苷酸的甲基化，沉默KISS1的表達(dá)促進(jìn)膀胱癌的侵襲［10］。

此外，本組有5例屬于非尿路上皮腫瘤（鱗癌3例，腺癌2例），其表達(dá)均為陽(yáng)性，這與膀胱鱗癌、腺癌表現(xiàn)更高的惡性度及更差的預(yù)后相符合。但統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與尿路上皮癌相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與收集病例數(shù)少有關(guān)。

綜上所述，本UHRF1在膀胱癌組織中高表達(dá)，并與臨床病理特征有一定關(guān)系。在膀胱癌患者中檢查UHRF1的表達(dá)水平，可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，并可有望成為新的分子標(biāo)記物及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)［11］。但由于受實(shí)驗(yàn)方法限制，本研究有一定局限性，如不能準(zhǔn)確測(cè)定表達(dá)的具體數(shù)值。后期可以開(kāi)展進(jìn)一步相關(guān)機(jī)制研究，如通過(guò)體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，干擾RNA的方法降低UHRF1的表達(dá)，了解其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。