王曉峰 倪益秀 莫少偉 程向東* 徐志遠 呂航

胃癌是全球癌癥死亡相關的第二大主要原因，僅次于肺癌［1］?；倍甯嗍腔倍婢臒崴崛〔课唬渑R床藥物槐耳金克顆粒已廣泛應用于包括肝癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中［2］。槐耳醇提物是槐耳真菌的正丁醇提取部位，且已證實能有效抑制人胃癌細胞的體外增殖［3］。已有研究報道槐耳水提物能與順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）等化療藥物聯(lián)合使用能增加化療敏感性，槐耳醇提物和化療藥物的聯(lián)合使用卻較少報道［4］。多藥耐藥關聯(lián)蛋白1（MRP1）主要是谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖醛酸等有機陰離子的活性轉運蛋白，通過主動轉運泵出細胞內(nèi)的外源性物質和藥物從而誘導腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性［5］。已有研究報道，在胃癌中，MRP1的表達與順鉑和5-氟尿嘧啶的耐藥相關［6］。2019年1月至7月作者通過體外實驗驗證槐耳水提物的抗腫瘤作用，對比不同部位的槐耳粗提物的抗增殖效應，探討槐耳醇提物與化療藥物聯(lián)合的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器（1）細胞株：人胃癌細胞株MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27購于中國科學院細胞庫。（2）試劑：槐耳清膏購于啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，槐耳清膏溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，配成100mg/ml，10ml于微孔濾膜過濾除菌后置于4℃保存待用；槐耳醇提物由浙江省中醫(yī)院中心實驗室提供，槐耳醇提物溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成100mg/ml，10ml微孔濾膜過濾除菌后置于4℃保存待用；順鉑、5-氟尿嘧啶購于中國MCE公司，順鉑溶于二甲基酰胺（DMF）中，配成12mg/ml，2ml置于4℃保存待用，5-氟尿嘧啶溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成15mg/ml，2ml置于4℃保存待用。PSB、DMF購于美國Hyclone公司；DMSO購于美國Amresco公司；胎牛血清FBS、胰蛋白酶EDTA、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購于杭州諾揚生物技術有限公司。MRP1抗體購于英國Abcam公司。β-actin購于美國CST公司。RIPA裂解液購于美國CST公司。BCA蛋白試劑盒購于美國賽默飛公司。（3）儀器：生物安全柜、CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、全波長酶標儀購于美國Thermo公司。

1.2 方法（1）細胞培養(yǎng)：人胃癌細胞MGC-803，BGC-823，AGS，HGC-27用 含 有10%胎 牛 血 清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，隔天觀察，及時處理以確保細胞狀態(tài)。（2）CCK-8實驗：收集對數(shù)生長期的MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27細胞，配制成5×104個/ml密度的細胞懸液，用排槍吸取細胞懸液接種至96孔板中，每孔100μl，并置于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。設立藥物組和對照組，藥物組設立6個濃度梯度且每個濃度設立3個復孔，對照組為不加任何藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基，除此外另設空白組，加入1640培養(yǎng)基，但不含藥物和細胞，為1640培養(yǎng)基背景值。每孔加入100μl藥物或1640培養(yǎng)基后置于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔加入10μlCCK-8溶液，于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后置于酶標儀下測在450nm處吸光度。計算細胞抑制率=（OD對照組-OD藥物組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。①單獨給藥：不同濃度的藥物（槐耳清膏、槐耳醇提物和DDP、5-Fu）對不同胃癌細胞的影響槐耳清膏濃度梯度為0、1.25、2.5、5、10、20mg/ml；槐耳醇提物為0、31.25、62.5、125、250、500μg/ml；DDP為0、3.75、7.5、15、30、60μg/ml（AGS、HGC-27和BGC-823），0、0.375、0.75、1.5、3、6μg/ml（MGC-803）；5-Fu為0、37.5、75、150、300、600μg/ml。實驗步驟同上。（注：槐耳清膏和槐耳醇提物為中藥粗提物，為避免藥物沉淀，測吸光度時應吸取到空白96孔板中）。②聯(lián)合給藥：槐耳清膏、槐耳醇提物聯(lián)合DDP、5-Fu對不同胃癌細胞的影響。計算不同胃癌細胞中不同藥物的IC10、IC20、IC30，設立聯(lián)合組和對照組，槐耳清膏和槐耳醇提物IC20、IC30分別聯(lián)合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30。實驗步驟同上。（3）蛋白質印跡分析：收集各GC細胞，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。使用BCA蛋白試劑盒定量蛋白質濃度。電泳、轉膜，用含有5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1h。然后用相應的MRP1、β-actin的一抗4℃過夜孵育，用TBST洗滌3次，并與適當?shù)亩乖谑覝叵路跤?h。用TBST洗滌3次后，曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 槐耳清膏、槐耳醇提物、DDP、5-Fu單獨給藥對不同胃癌細胞增殖的影響實驗結果表明，槐耳水提物、槐耳醇提物和DDP、5-Fu對人胃癌細胞AGS、MGC-803、HGC27、BGC823的增殖有不同程度抑制，且呈劑量依賴性，見圖1?；倍甯鄬Σ煌赴┘?胞（AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823）的 半數(shù)抑制率（IC50）為10.62、4.032、5.494、4.560mg/ml；槐耳醇提物對不同胃癌細胞的IC50為165.3、97.24、203.9、166.7μg/ml；DDP對不同胃癌細胞的IC50為24.49、1.927、8.272、6.512μg/ml；5-Fu對不同胃癌細胞的IC50為117.2、236.8、88.34、234.3μg/ml。比較在不同胃癌細胞的增殖抑制率達50%時的劑量，槐耳清膏為4.031~10.62mg/ml，槐耳醇提物為97.24~203.9μg/ml，槐耳醇提物所需劑量小于槐耳清膏，表明在不同槐耳活性部位，醇提物的抑瘤效益好于水提物。

圖1 槐耳水提物、槐耳醇提物、順鉑、5-氟尿嘧啶對不同胃癌細胞增殖的影響

2.2 槐耳清膏、槐耳醇提物聯(lián)合DDP、5-Fu對不同胃癌細胞增殖的影響實驗結果表明，槐耳清膏和槐耳醇提物的IC20、IC30聯(lián)合DDP和5-Fu的IC10、IC20、IC30后均有效的增強化療藥物的腫瘤增殖抑制作用（見表1）。在各胃癌細胞中，DDP與槐耳水提物和醇提物的聯(lián)合中（見圖2A-D），以及5-Fu與槐耳水提物和醇提物的聯(lián)合中（見圖2E-H），醇提物的聯(lián)合效用優(yōu)于槐耳清膏。此外，隨著槐耳粗提物濃度的增加，這種增強化療藥物對胃癌細胞殺傷的聯(lián)合作用更加明顯。對比槐耳醇提物與順鉑、5-氟尿嘧啶的聯(lián)合作用（見圖3A-D），在同IC值的濃度下，醇提物與DDP的聯(lián)合作用比醇提物與5-Fu的聯(lián)合作用更加明顯。此外，低濃度的槐耳醇提物對化療藥物對胃癌細胞殺傷力的增強效果并不明顯。

表1 槐耳水提物、槐耳醇提物、順鉑、5-氟尿嘧啶對不同胃癌細胞的IC10、IC20、IC30值

圖2 槐耳水提物、槐耳醇提物聯(lián)合化療藥物（順鉑、5-氟尿嘧啶）后對不同胃癌細胞增殖的影響（*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001）

圖3 順鉑、5-氟尿嘧啶聯(lián)合槐耳醇提物后對不同胃癌細胞增殖的影響（*P<0.05和**P<0.01）

2.3 槐耳醇提物能夠顯著抑制耐藥相關蛋白MRP1的表達實驗結果表明，用槐耳醇提物處理24h后的MRP1蛋白表達量顯著下調，表明槐耳醇提物增加各胃癌細胞對化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶的敏感性可能與下調MRP1表達有關。

圖4 槐耳醇提物通過抑制耐藥相關蛋白MRP1影響化療藥物的敏感性

3 討論

槐耳清膏是槐耳菌質發(fā)酵后的熱水提取物，其活性成分主要是多糖蛋白，是一種易溶于水，含有多糖41.53%、氨基酸12.93%、水分8.72%棕褐色粉末?；倍甯啵ɑ倍鹂祟w粒）已證實對癌癥治療有明顯的療效［7］。在胃癌領域中，已有大量研究報道槐耳清膏能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，誘導胃癌細胞凋亡，逆轉化療藥物的耐藥［8-9］。作者前期已經(jīng)通過系統(tǒng)溶劑法將槐耳提取為水、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇五個活性部位，并證實正丁醇部位對MKN-45細胞的抑制作用最佳［10］。

本資料結果表明，槐耳水提物和槐耳醇提物均能有效抑制不同胃癌細胞的增殖，且在同一抑制率中，醇提物的藥物劑量低于水提物，表明槐耳醇提物具有與槐耳水提物一樣的抗腫瘤作用，且抑制效率優(yōu)于水提物?；熕幬锶珥樸K、5-氟尿嘧啶等作為一線化療藥物廣泛應用在胃癌領域。但化療藥物均存在諸多不良反應，包括神經(jīng)毒性、耳毒性、免疫抑制等。已經(jīng)有大量研究驗證槐耳水提物可以通過多種機制增強化療藥物的抗腫瘤作用。本資料表明，槐耳醇提物與化療藥物DDP、5-Fu聯(lián)用后能有效增強化療藥物對不同胃癌細胞的殺傷，且在發(fā)現(xiàn)槐耳醇提物與順鉑聯(lián)用更有效的增強化療藥物對胃癌細胞的殺傷作用。

本資料顯示，槐耳醇提物顯著下調MRP1的表達。MRP1是一種膜結合糖蛋白，賦予腫瘤細胞對包括順鉑、5-Fu在內(nèi)的多種化療藥物的抗性，是目前研究比較廣泛導致多藥耐藥（MDR）的機制之一。槐耳醇提物增加順鉑和5-Fu敏感性，可能是下調MRP1的表達，從而導致順鉑、5-Fu在胞內(nèi)濃度增加，增強化療藥物對胃癌細胞的殺傷。

綜上所述，槐耳醇提物在體外實驗中的抗腫瘤作用優(yōu)于槐耳水提物，且槐耳醇提物和順鉑聯(lián)合使用明顯增強順鉑的腫瘤抑制作用，作者后續(xù)將從分子角度繼續(xù)進行槐耳醇提物的抗腫瘤作用及如何提升順鉑的敏感性的機制研究。