江圣圭，董志穎，李 卿，趙英魁，黃豆豆，孫連娜,（. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 50；. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 00；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 0000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海00）

鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）為菊科（Compositae）鼠曲草屬（Gnaphalium）的一年生草本，亦稱鼠麴草、佛耳草、清明菜、鼠耳草等，是一種藥食同源的植物。我國的鼠曲草主要分布在黃河流域以南，它是我國南方民間傳統(tǒng)食物“鼠曲粿”的食材來源；同時(shí)，也是一味傳統(tǒng)中藥，最早記載于《名醫(yī)別錄》，具有止咳化痰、祛風(fēng)平喘的功效。由于其兼具營養(yǎng)和藥用價(jià)值，對鼠曲草的研究主要集中在化學(xué)成分[1-3]、藥理作用[4-6]以及營養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)利用等方面。課題組前期研究[7]表明，不同產(chǎn)地鼠曲草的化學(xué)成分含量存在差異，因此，擬采用簡單重復(fù)序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat,ISSR）分子標(biāo)記手段探究其內(nèi)在原因。

DNA分子標(biāo)記可以從核苷酸序列水平反映物種遺傳變異差異，具有方便、可靠、準(zhǔn)確等優(yōu)勢。ISSR技術(shù)是在簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，ISSR與SSR相比于其他分子標(biāo)記手段，具有穩(wěn)定可靠、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[8]。此外，ISSR相較于SSR，具有多態(tài)性高、引物通用、無須測序及設(shè)計(jì)引物等優(yōu)勢[9]。采用分子標(biāo)記手段探究居群間的差異具有便捷、干擾小等優(yōu)點(diǎn)。為了從分子水平闡明不同產(chǎn)地鼠曲草之間的差異，本研究首先對鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，其次在最適反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上篩選引物及相應(yīng)的退火溫度，最后采用不同產(chǎn)地鼠曲草的基因組DNA進(jìn)行體系驗(yàn)證，為進(jìn)一步開發(fā)利用鼠曲草提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 樣品來源

2017年春，從我國不同省市采集鼠曲草植株（表1），樣品由課題組孫連娜副教授鑒定為鼠曲草Gnaphalium affineD.Don，摘下葉片，經(jīng)液氮預(yù)凍后保存于-80 ℃冰箱中，備用。

表1 鼠曲草樣品信息表

1.2 儀器與試劑

植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；DK-8D三孔電熱恒溫水槽（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；5418R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo公司）；Mastercycler Pro梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；JS-350多功能水平電泳槽、JS-Power 600電泳儀、JS-2000全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；ISSR通用引物（Genewiz公司）；PremixTaqDNA聚合酶、6× Loading Buffer、DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker（Takara Bio公司）；溴化乙錠（ethidium bromide, EB；上海博光生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA的提取及檢測

采用試劑盒法從鼠曲草葉片中提取基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測定其濃度及純度后，置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

2.2 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立

在反應(yīng)體系中加入預(yù)混酶、DNA模板、引物，并用滅菌水補(bǔ)至20 μl。按照PCR程序完成擴(kuò)增后，以DL2000 DNA Marker為對照，EB為指示劑，采用1.6%瓊脂糖凝膠，在“55 V，90 min”電泳條件下對擴(kuò)增條帶進(jìn)行分離。

2.3 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

首先通過單因素法，以來自福建泉州的鼠曲草樣品（S7）作為DNA模板，序列為（CA）8G的818作為引物，分別確定DNA模板量及引物濃度的最優(yōu)值；然后以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中心，進(jìn)行全面考察實(shí)驗(yàn)，以“位點(diǎn)清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好”為標(biāo)準(zhǔn)，最終確定鼠曲草ISSR-PCR最適反應(yīng)體系。

2.4 引物篩選及退火溫度的確定

根據(jù)公式Tm值（解鏈溫度）=4 × （G + C） + 2 ×（A + T）計(jì)算出各引物的Tm值，并按Tm值將100條引物進(jìn)行排序并且分類。選用福建寧德（S1）和湖北恩施（S2）的鼠曲草樣品作為考察對象，采用最適反應(yīng)體系，以Tm值為中心，在（Tm- 2）～（Tm+ 4）范圍內(nèi)設(shè)置6個(gè)溫度，同時(shí)進(jìn)行引物篩選及退火溫度篩選，確定各引物的Tc值（中心溫度），剔除擴(kuò)增條帶數(shù)為0或1的引物，完成初篩。

以來自福建寧德的鼠曲草樣品（S1）作為模板，選取Tc-2、Tc、Tc+2這3個(gè)溫度，采用最適反應(yīng)體系對通過初篩的引物進(jìn)行考察，以“位點(diǎn)清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好”為標(biāo)準(zhǔn)，完成二次篩選并確定最佳退火溫度。

2.5 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

采用前述實(shí)驗(yàn)確定的最適反應(yīng)體系、引物及退火溫度，對8個(gè)居群的鼠曲草DNA模板進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記以驗(yàn)證體系的穩(wěn)定性。同時(shí)，根據(jù)電泳結(jié)果以“位點(diǎn)清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好”為標(biāo)準(zhǔn)對通過二篩的引物再次進(jìn)行篩選。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA的提取及檢測

經(jīng)試劑盒法提取得到的基因組DNA電泳結(jié)果（圖1）顯示：條帶完整，無明顯彌散；且經(jīng)微量分光光度計(jì)檢測其OD260/OD280均在1.7～1.9之間，表明提取的DNA純凈，無核酸、肽類干擾，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立

ISSR-PCR反應(yīng)體系包含dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、DNA模板。相關(guān)研究表明，DNA模板、TaqDNA聚合酶、引物的用量是ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要影響因素[10-12]。并且多項(xiàng)關(guān)于dNTPs、Mg2+、Taq酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)混酶體系（表2）可以滿足實(shí)驗(yàn)需求[12-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用PremixTaqDNA聚合酶，不另加dNTPs和Mg2+，這也在一定程度上簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，并減小了實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 預(yù)混酶的組成及濃度

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10-14]確定鼠曲草ISSR-PCR初始反應(yīng)體系為：10 μl PremixTaq酶、0.8 μmol/L引物、30 ng DNA模板、滅菌水加至20 μl；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4 ℃預(yù)變性5 min；②94 ℃變性30 s，退火溫度下復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)38次；③72 ℃延伸10 min。

3.3 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.3.1 單因素法考察引物濃度和DNA模板量

當(dāng)DNA模板量不變時(shí)，不同引物濃度擴(kuò)增出的條帶情況（圖2）顯示：引物濃度為0.3 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定；引物濃度為0.4 μmol/L時(shí)，可以檢測出模糊的擴(kuò)增條帶。此外，引物濃度＜0.3 μmol/L或＞0.4 μmol/L時(shí)，均無擴(kuò)增條帶。

當(dāng)引物濃度不變時(shí)，不同DNA模板量的擴(kuò)增情況（圖3）顯示：DNA模板量為10～40 ng時(shí)，均可檢測出擴(kuò)增條帶，且模板量為10 ng時(shí)擴(kuò)增出2條條帶，其余均為1條；DNA模板量＞40 ng時(shí)，無擴(kuò)增條帶。

3.3.2 全面實(shí)驗(yàn)確定ISSR-PCR最適反應(yīng)體系

圍繞單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置4個(gè)引物濃度值及4個(gè)DNA模板量，進(jìn)行16組實(shí)驗(yàn)（表3）。全面實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示：當(dāng)DNA模板量為10 ng時(shí)，不同引物濃度下的擴(kuò)增條帶穩(wěn)定，且重復(fù)性好；當(dāng)DNA模板量為15 ng時(shí)，僅6、7兩組擴(kuò)增出條帶；當(dāng)DNA模板量為20 ng時(shí)，雖然各組均擴(kuò)增出條帶，但是條帶亮度不穩(wěn)定；當(dāng)DNA模板量為25 ng時(shí)，僅14未擴(kuò)增出條帶。綜上，10 ng DNA模板組（1～4）擴(kuò)增出的條帶最為清晰且穩(wěn)定性最好，0.30 μmol/L引物濃度組在各DNA模板量下均擴(kuò)增出條帶，呈現(xiàn)出的穩(wěn)定性強(qiáng)于其余濃度，因此確定最適反應(yīng)體系包含10 ng DNA模板量和0.3 μmol/L引物，且此結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 引物和DNA模板的全面實(shí)驗(yàn)考察

3.4 引物篩選及退火溫度的確定

引物初篩是對比相同引物、不同退火溫度下的擴(kuò)增情況。經(jīng)初篩剔除58條引物，包含27條Tm值過高（＞57 ℃）或Tm值過低（＜48 ℃）的引物。此外，通過初篩發(fā)現(xiàn)，由于數(shù)個(gè)退火溫度連續(xù)值呈現(xiàn)出的擴(kuò)增情況類似（圖5），難以確定最佳退火溫度。因此，有必要進(jìn)行二次篩選。

根據(jù)初篩確定中心溫度值Tc，即能呈現(xiàn)出最佳擴(kuò)增狀態(tài)的溫度范圍的中間值。設(shè)置Tc-2、Tc、Tc+2這3個(gè)退火溫度，對通過初篩的42條引物進(jìn)行二次篩選，大部分引物的Tc值和Tm值相同。引物二篩既能橫向?qū)Ρ炔煌?、相同退火溫度下的擴(kuò)增情況（圖6），又能縱向?qū)Ρ认嗤?、不同退火溫度下的擴(kuò)增情況，并確定引物的最佳退火溫度。

引物經(jīng)二篩后剔除25條引物，并且確定了余下17條引物的最佳退火溫度（表4）。

3.5 鼠曲草ISSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

驗(yàn)證結(jié)果表明該體系穩(wěn)定可靠，適合用于進(jìn)一步遺傳多樣性分析；此外，最終確定了10條引物，它們分別是810、816、834、846、847、848、857、861、878、891（圖7）。

4 討論

由于分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因標(biāo)記、遺傳多樣性等方面的研究[15]。對于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，反應(yīng)體系各參數(shù)的變化會影響條帶的清晰程度甚至有無[16]，因此對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化具有必要性。本研究重點(diǎn)對DNA模板量、引物濃度、引物及退火溫度進(jìn)行篩選優(yōu)化。

體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均僅呈現(xiàn)單一條帶，這可能與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選用的DNA模板及引物有關(guān)。此外，體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明引物濃度對條帶亮度及清晰度的影響不是按固定規(guī)律進(jìn)行的，還受DNA模板量的影響。當(dāng)DNA模板量在一定范圍內(nèi)擴(kuò)增情況相同時(shí)，應(yīng)選擇DNA模板量的最小值[13]。在全面實(shí)驗(yàn)中，僅模板量為10 ng時(shí)，在各引物濃度下擴(kuò)增穩(wěn)定，表明在該條件下擴(kuò)增受引物濃度的影響較小，整個(gè)擴(kuò)增過程穩(wěn)定性強(qiáng)。推測其原因是較低的DNA模板量能與引物更加充分地結(jié)合，隨之更加穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增。

表4 通過二篩引物的序列及最佳退火溫度

當(dāng)進(jìn)行引物及退火溫度篩選時(shí)，在保證有效退火的前提下，選擇較高的退火溫度，以此增加反應(yīng)的特異性[13]。本研究引入了Tc值，此舉不僅對首輪篩選進(jìn)行查漏補(bǔ)缺，還節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，也提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外，通過二次篩選的引物（表3）以CA和GA重復(fù)單元為主，這提示我們：鼠曲草基因組DNA中的微衛(wèi)星序列可能以GT和CT重復(fù)單元為主，且菊科植物存在相似重復(fù)單元[17]。綜上，本實(shí)驗(yàn)最終確定了一個(gè)穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的反應(yīng)體系，并篩選出了擴(kuò)增位點(diǎn)清晰、多態(tài)性好的適用引物，為鼠曲草后續(xù)遺傳多樣性研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。