潘鵬超，陳嘯飛，諶 衛(wèi)，郭志勇，柴逸峰（海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 藥學(xué)院藥物分析教研室，. 長海醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200433）

0 引言

復(fù)方金錢草顆粒由廣金錢草、車前草、光石韋以及玉米須四味中藥組成，為成方制劑，收錄于《中國藥典》（2015年版），該藥具有清熱利濕、通淋排石的作用，在臨床上常用于泌尿系結(jié)石、尿路感染證候者[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明復(fù)方金錢草顆粒具有利尿、抑制泌尿系結(jié)石形成、抗炎、抗氧化作用，能有效抑制結(jié)晶腎損傷，其中，廣金錢草作為君藥，發(fā)揮主要藥理作用，車前草和光石韋也起到一定輔助作用[4-7]。經(jīng)鑒定，復(fù)方金錢草顆粒中主要成分包含黃酮類、萜類、生物堿類、酚酸類、甾醇類、多糖類、揮發(fā)油等[8-9]。近年來研究表明，其主要活性成分為黃酮類、萜類、酚酸類以及多糖類[10-12]。因其成分復(fù)雜，極性強弱各異，目前的中藥提取方法主要有煎煮法、加熱回流法、半仿生提取法等[13-15]。然而，這些方法對于復(fù)方金錢草顆粒中指標(biāo)性有效成分提取的效率尚無系統(tǒng)研究，因此，目前復(fù)方金錢草顆粒尚無通用的提取工藝，有效成分含量未知。

正交試驗因其具有較高的科學(xué)性，較短的操作時間以及簡單的實驗步驟被廣泛應(yīng)用于中藥材提取工藝優(yōu)化[16]。響應(yīng)曲面法通過直觀的等高線圖和三維立體圖比較各因素的相互作用且能通過回歸模型預(yù)測最佳提取參數(shù)，從而在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本研究通過結(jié)合正交試驗和響應(yīng)面分析法兩種統(tǒng)計學(xué)方法，在選定14個復(fù)方金錢草顆粒代表性有效成分的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到有效成分含量最大化提取工藝，為后續(xù)該藥物的藥理藥效研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

200 g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；BP121S電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Heraeus Multifuge X1R臺式離心機（美國Thermo公司）；Agilent1290 液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 6538 飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

分析純無水乙醇(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；質(zhì)譜純乙腈（Merck,Germany）、甲酸（Merck,Germany）；超純水（Milli-Q A10超純水制備系統(tǒng)美國Millipore公司）；二甲基亞砜（Merck,Germany）；芹菜素對照品、木犀草素對照品、大豆皂苷Ⅰ對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；復(fù)方金錢草顆粒（每袋裝10 g）來源于長海醫(yī)院腎內(nèi)科。

2 試驗方法

2.1 試驗因素水平選擇

通過前期的文獻(xiàn)調(diào)研以及對復(fù)方金錢草顆粒提取主要因素的考慮，筆者選取超聲提取時間（A）、超聲溫度（B）、乙醇比例（C）作為試驗因素并確定了其因素水平表，具體見表1。

2.2 對照品溶液的制備

表1 試驗因素水平表

分別精密稱取芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ對照品各5 mg，加一定量的二甲基亞砜（DMSO）溶解，得到濃度均為80 mmol/L的對照品溶液。

2.3 復(fù)方金錢草顆粒供試品溶液的制備

取復(fù)方金錢草顆粒進(jìn)行初步粉碎，精密稱取2.0 g，置于50 ml錐形瓶中，根據(jù)試驗方案加入不同比例的乙醇提取液25 ml，稱定質(zhì)量并記錄，并按各提取條件進(jìn)行超聲加熱回流提取藥液，經(jīng)室溫冷卻后，再次稱定并用提取液補足損失的質(zhì)量，15 000 r/min離心20 min，取上清液并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得各供試品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：XBridge BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見表2；進(jìn)樣量為3 μl，流速為0.4 ml/min，柱溫為40 ℃。

表2 梯度洗脫條件

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（正離子模式）；質(zhì)量掃描范圍:50～1 500m/z；干燥氣溫度: 350 ℃；干燥氣流速:11.0 L/min；霧化氣壓力: 45 psig；毛細(xì)管電壓: 4 000 V；碎片電壓: 120 V。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.6.1 芹菜素

取芹菜素對照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.676、1.351、2.027、2.702、6.756、13.512 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.6.2 木犀草素

取木犀草素對照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.217、0.716、1.073、1.431、3.578、7.156 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.6.3 大豆皂苷Ⅰ

取大豆皂苷Ⅰ對照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為1.886、7.545、11.317、15.090、22.635、45.270 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.7 精密度試驗

取濃度為4.054 μg/ml的芹菜素、2.147 μg/ml的木犀草素、18.862 μg/ml的大豆皂苷Ⅰ混合對照品溶液，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣，在1 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，并且連續(xù)進(jìn)樣4 d，測定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計算其各自的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）,考察其日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.8 重復(fù)性試驗

取復(fù)方金錢草顆粒提取液，平行制備6份，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計算其各自的RSD值,考察其重復(fù)性。

2.9 回收率試驗

精密量取一定濃度的芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ混合對照品溶液和已知含量的復(fù)方金錢草顆粒提取液各0.5 ml混合，平行制備6份，按“2.4”“2.5”項條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計算其各自的含量和RSD值，考察其加樣回收率。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取復(fù)方金錢草顆粒提取液，按“2.4”“2.5”項條件分別在0、6、12、24、48 h進(jìn)樣，測定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計算各自的RSD值，考察其穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 芹菜素

如圖1A所示，回歸方程為Y=50 999X+33 373，r=0.999 9，表明芹菜素在0.676～13.512 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.2 木犀草素

如圖1B所示，回歸方程為Y=45 861X+15 784，r=0.999 9，表明木犀草素在0.215～7.156 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.3 大豆皂苷Ⅰ

如圖1C所示，回歸方程為Y=19 763X+68 383，r=0.999 9，表明大豆皂苷Ⅰ在1.886 ～45.270 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗結(jié)果

由表3可知，日內(nèi)精密度試驗中，芹菜素的RSD為0.98%，木犀草素的RSD為1.90%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為2.18%，說明這3個化合物的日內(nèi)精密度良好。日間精密度試驗中，芹菜素的RSD為1.53%，木犀草素的RSD為0.87%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為1.40%，說明這3個化合物的日間精密度良好。

表3 日內(nèi)、日間精密度試驗結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

平行制備復(fù)方金錢草顆粒提取液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算，結(jié)果芹菜素的RSD為3.09%，木犀草素的RSD為2.83%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為2.21%。說明復(fù)方金錢草顆粒提取液進(jìn)樣測定的重復(fù)性良好。

3.4 回收率試驗結(jié)果

由表4可知，芹菜素的平均回收率為99.58%，其RSD為1.24%；木犀草素的平均回收率為101.07%，其RSD為1.83%；大豆皂苷Ⅰ的平均回收率為100.59%，其RSD為1.22%，說明該測定方法準(zhǔn)確性良好。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

3.5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由圖2可知，復(fù)方金錢草顆粒提取液在0、6、12、24、48 h共進(jìn)樣5次，3個成分的峰面積在48 h內(nèi)無明顯波動，計算得芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的RSD分別0.86%、3.83%、1.44%，說明復(fù)方金錢草顆粒提取液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 正交試驗設(shè)計與實驗結(jié)果

為探討復(fù)方金錢草顆粒最佳提取工藝，筆者采用復(fù)方金錢草顆粒中的指標(biāo)性成分的峰面積之和來代表其提取效果。共選取14種不同的化合物，為代表其合理性，在各味藥材中都選取一定數(shù)量的化合物，主要為經(jīng)文獻(xiàn)報道的有藥理作用的成分以及各味藥材中含量相對較高的成分。筆者采用UHPLC-TOF/MS對復(fù)方金錢草顆粒提取成分進(jìn)行鑒定，得到其質(zhì)譜總離子流圖及提取離子流圖（圖3），其化合物詳細(xì)信息見表5。

采用L9(33)正交試驗表劃分各個試驗的因素水平，其具體的試驗方案和結(jié)果分析見表6。根據(jù)表6的試驗結(jié)果分析，通過比較K值，得到其提取最優(yōu)參數(shù)水平為A1、B2、C2，通過比較極差R值，可以看到因素A的極差最大，其次為C、B，即超聲提取時間對復(fù)方金錢草顆粒的提取效果影響最大，其次是乙醇比例，最后是超聲溫度。結(jié)果表明，適宜超聲提取時間和溫度能促進(jìn)化合物的溶出，但當(dāng)超聲提取時間過長、溫度過高時，可能會破壞物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得溶出的化合物含量反而降低；適宜的乙醇比例可以使復(fù)方金錢草顆粒中的水溶性和脂溶性成分都能最大限度的溶出。

表5 復(fù)方金錢草指標(biāo)性有效成分列表

表6 正交試驗結(jié)果與分析

進(jìn)一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素對復(fù)方金錢草顆粒的提取效果由F值和P值進(jìn)行檢驗，具體結(jié)果見表7。

對表7結(jié)果進(jìn)行分析，影響復(fù)方金錢草顆粒提取效果的因素中，A＞C＞B，這與上述根據(jù)表6的極差得到的結(jié)果一致。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，因素A和因素C的P值＜0.05，差異顯著，而因素B＞0.05,其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表7 方差分析表

3.7 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計與實驗結(jié)果

采用軟件Design-Expert 10，以超聲提取時間、超聲溫度、乙醇比例為自變量，指標(biāo)性化合物峰面積之和為響應(yīng)值設(shè)計試驗。共設(shè)17組試驗點，其中，分析點12個，零點5個，零點代表重復(fù)實驗，常用于估算試驗誤差。本試驗方案及結(jié)果見表8。

將表8的試驗結(jié)果輸入Design-Expert 10軟件進(jìn)行綜合分析，可以得到復(fù)方金錢草顆粒指標(biāo)性成分峰面積之和與各因素變量的回歸方程模型：

通過對表9的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，可以看到該模型的P＜0.01，r=0.960，失擬項顯著，說明該模型雖存在試驗誤差，但模型擬合度較好，能夠用來預(yù)測復(fù)方金錢草提取效果與各因素變量的關(guān)系。同時，各因素顯著性分析顯示,超聲提取時間（A）以及乙醇比例（C）的P＜0.05，說明它們對復(fù)方金錢草顆粒的提取效果作用明顯，而超聲溫度對其提取效果影響不顯著，這與前面的正交試驗結(jié)果相一致。

表8 響應(yīng)曲面試驗方案及結(jié)果

表9 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

3.8 響應(yīng)曲面各因素間的交互分析

利用Design-Expert 10軟件可以得到其等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖，如圖4所示。其中，等高線的形狀反映兩者交互作用的強弱，圓形代表交互作用弱，橢圓形代表交互作用強。觀察發(fā)現(xiàn)，A圖顯示的超聲提取時間和乙醇比例交互作用最強，B圖顯示的超聲提取時間和超聲溫度交互作用次之，C圖顯示的超聲溫度和乙醇比例交互作用最弱。

3.9 復(fù)方金錢草顆粒最優(yōu)提取參數(shù)預(yù)測及驗證

使用回歸模型進(jìn)行最優(yōu)提取參數(shù)預(yù)測，得到當(dāng)超聲提取時間為10 min，超聲溫度為55.12 ℃，乙醇比例為54.56%時，得到的指標(biāo)性峰面積之和為77 471 863.44。結(jié)合實際操作，選用超聲提取時間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%進(jìn)行驗證，經(jīng)3次平行試驗，得到其平均值為77 978 123.33，RSD為1.91%，與模型的預(yù)測值基本一致，表明該預(yù)測模型的穩(wěn)定性強、適用性良好。

4 結(jié)論

本研究的評價指標(biāo)為14個指標(biāo)性有效成分的峰面積之和，以乙醇為提取溶劑，采用正交試驗和響應(yīng)曲面法進(jìn)行復(fù)方金錢草顆粒提取工藝的優(yōu)化，正交試驗結(jié)果顯示，其最佳提取工藝參數(shù)為超聲提取時間10 min，超聲溫度60 ℃，乙醇比例50%；響應(yīng)曲面法則通過回歸模型對復(fù)方金錢草顆粒提取工藝參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，得到其預(yù)測的最佳參數(shù)為：超聲提取時間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%，通過兩種試驗方法得到的參數(shù)基本一致，且通過響應(yīng)曲面法預(yù)測得到的峰面積之和更大。綜上所述，我們選擇工藝參數(shù)為：超聲提取時間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%，并在此提取條件下進(jìn)行驗證，其UHPLC-TOF/MS圖譜中峰面積之和平均值為77 978 123.33，說明該模型穩(wěn)定可靠，可以用于復(fù)方金錢草顆粒的提取。

由于前期采用水提法提取復(fù)方金錢草顆粒，導(dǎo)致水溶性小的成分沒有被完全提取出來，故而改進(jìn)方法，采用一定比例的乙醇溶液為提取溶劑，并且優(yōu)化了最佳提取時間和溫度，使得其指標(biāo)性有效成分都能被有效提取，并為后續(xù)復(fù)方金錢草的藥效和藥理研究提供可靠的方法依據(jù)。