陳冬平，陳志廷，徐漢虹，林 菲

(天然農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda是一種原產(chǎn)于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)的雜食性害蟲，嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。其寄主范圍廣，能夠為害玉米、水稻、棉花、大豆等80 多種作物[1]。不同的草地貪夜蛾群體通常對特定作物具有取食趨性[2]。田間草地貪夜蛾主要分為玉米型(Corn strain)和水稻型(Rice strain)2 個亞群[3]。玉米型主要取食玉米、高粱、棉花，而水稻型的取食性相對較為廣譜，主要取食水稻、苜蓿、牧草、小米等作物[4]。除了取食偏好外，2 個品系的草地貪夜蛾在生理特征、交配行為和性外激素的組成方面有很大的不同。但是，由于2 種寄主型形態(tài)學和行為方面的相似性，在田間難以被區(qū)分開[5]。因此，對2 種寄主型的草地貪夜蛾開展分子鑒定，將有助于了解該入侵物種的遺傳結構，掌握害蟲的入侵和擴散規(guī)律以及制定有效的防控策略[6-7]。

草地貪夜蛾亞群的分類主要根據(jù)田間采集的幼蟲寄主范圍，并結合分子標記的分化進行界定?；诰€粒體細胞色素C 氧化酶亞基I 基因(COI)的分子標記不僅能夠區(qū)分玉米型和水稻型2 個亞群的，而且具備鑒別其亞型的能力，是目前最常用的有效分子條形碼[7-10]。另外，有研究表明，根據(jù)Z 染色體上編碼磷酸丙糖異構酶基因(Tpi)開發(fā)的分子標記，能夠更好地鑒定到草地貪夜蛾雌性“水稻型”和雄性“玉米型”的雜交型[7,11]。2 種標記有機結合能夠提高鑒定的準確率[12-13]。

2018 年底草地貪夜蛾通過中緬邊境進入我國境內(nèi)，目前已在云南、湖南、廣西、廣東等地發(fā)現(xiàn)其對玉米的為害[14]。廣東省是水稻主要種植區(qū)，嚴密監(jiān)測草地貪夜蛾是否存在為害水稻的風險顯得格外重要[15]。另外，廣東省為熱帶和亞熱帶季風氣候區(qū)，草地貪夜蛾可在該省越冬，是可阻止其北遷的橋頭堡[16]。本研究通過基于COI和Tpi2 個基因片段的分子標記，比較它們對入侵廣州的草地貪夜蛾的鑒別能力，為監(jiān)測蟲源擴散規(guī)律以及預測預警蟲情提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲采集

供試草地貪夜蛾于2019 年5 月12 日在廣州花都花山鎮(zhèn)儒林村玉米地采集。寄主為喇叭口期的春玉米，所有樣本均為4～6 齡幼蟲，6 個樣本分別標記為1#、2#、3#、4#、5#和6#。單頭活體幼蟲采集后放入含有新鮮玉米葉片的50 mL 離心管，帶回實驗室進行形態(tài)學鑒定后，用液氮速凍儲存于?80 ℃用于DNA 提取。

1.2 DNA 提取和擴增

采用DNA/RNA 共提取試劑盒(TIANGEN，中國)分別提取單頭幼蟲DNA 和RNA。蟲體放入含有1.5mL DNA 抽提液的2mL 離心管內(nèi)，加入鋼珠，放入樣品研磨機(Bullet Blender?，美國)處理后，按照試劑盒說明書操作。DNA 使用NanoDrop分光光度計(2000，賽默飛世爾)測定質量濃度，稀釋到10 ng/μL 后，用作PCR 擴增模板。

用于PCR 擴增COI和Tpi部分基因片段的引物如表1 所示，選用的PCR 引物在COI基因的相對位置如圖1 所示。采用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase PCR(TaKaRa，日本)進行PCR 擴增，反應體系包括PrimeSTAR?Max DNA Polymerase PCR(2×)10μL，上游引物和下游引物各0.4μL，模板1μL，加ddH2O 至20μL；PCR 反應為：98℃預變性2min；98℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

表1 擴增COI 和Tpi 基因片段所用引物Table 1 Prim ers used for am p lifying COI and Tpi gene fragments

圖1 用于單倍型分析的COI 基因3 個片段Fig.1 Three fragments of COI gene used for haplotype analysis

使用15 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段特異性后，PCR 產(chǎn)物由廣州天一輝遠基因科技有限公司進行切膠測序。對于測序結果為雙峰或者低質量的樣品，則將其PCR 產(chǎn)物克隆到pEASY?-Blunt Cloning Vector 后，每個樣品各挑取10 個克隆進行測序。

1.3 序列分析

利用Lastergene 軟件包對正反向測序序列進行人工拼接、峰型校正和序列比對。從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載已經(jīng)發(fā)布的草地貪夜蛾COI和Tpi基因序列。針對已報道的基于COI和Tpi基因序列的“水稻型”和“玉米型”單倍型特點，分別進行差異位點分析，確定本研究中草地貪夜蛾的具體亞型。

2 結果與分析

2.1 COI 標記鑒定草地貪夜蛾單倍型

利用標記COI-A，COI-B 和COI-C 對所采集的6 個樣品進行了寄主型分析。結果（圖2）顯示，有5 個樣品擴增出了預期大小的單一特異性條帶，將其PCR 產(chǎn)物用于直接測序。

對COI-A 的序列分析表明，來自4 個樣品(1#、2#、4#、6#) 的序列與已報道的草地貪夜蛾水稻型(HM 136593) 僅存在一處堿基差異，與玉米型(HM 136586)存在8 處單堿基差異，說明根據(jù)COIA 標記鑒定的寄主型與實際樣品來源寄主型并不一致(圖3)；對樣品3#的COI-A 產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn)其為雙峰雜合，克隆重新測序后，分別獲得了樣品3#-1 和3#-2 兩種單倍型。其中，3#-1 與上述4 個樣品檢測到的單倍型完全一致，3#-2 則與Mythimna separate(KX863042) 對應的片段序列上存在1 個堿基的差異，說明3#樣品可能是草地貪夜蛾和M.separate的雜合(圖3)。

圖2 6 頭草地貪夜蛾CO I-A、CO I-B 和CO I-C 標記的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification of CO I-A, COI-B and COI-C markers from six Spodoptera frugiperda

圖3 基于COI-A 標記的單倍型序列比對Fig.3 Hap lotype sequence slignments based on COI-A markers

進一步用COI-B 和COI-C 標記對樣品進行寄主型鑒定，結果表明，除了樣品5#無法擴增出條帶之外，其余的5 個樣品均擴增出單一的預期條帶。PCR 產(chǎn)物測序結果顯示所測樣品序列完全一致且為水稻型(圖2)。

將COI-A、COI-B 和COI-C 等3 個標記的結果相比較，發(fā)現(xiàn)COI-A 能夠區(qū)分出草地貪夜蛾和M.separate的2 種單倍型，而COI-B 和COI-C 僅能區(qū)分出草地貪夜蛾1 種單倍型，說明雖然基于COI基因片段序列鑒定到的草地貪夜蛾寄主型與實際采集寄主種類不相符，但是，COI-A 標記具有較好的物種鑒別能力，能夠區(qū)分出雜合類型。

2.2 TPi 標記鑒定草地貪夜蛾單倍型

基于Tpi基因片段對所采集的6 個樣品進行了寄主型分析。除了樣品5#無法擴增出條帶之外，其余的5 個樣品均擴增出了預期大小的單一特異性條帶(圖4)。

圖4 6 頭草地貪夜蛾Tpi 基因片段的PCR 擴增Fig.4 PCR amplification of Tpigene fragment from six Spodoptera frugiperda

對PCR 產(chǎn)物進行雙向測序并分析其序列差異，結果顯示，所檢測的序列與已報道玉米型一致，說明基于Tpi基因片段的鑒定結果與樣品的寄主來源是一致的。樣品2#和樣品3#，在第126 和127 堿基處出現(xiàn)GA/AT 的雜合雙峰(圖5)，說明入侵廣東的草地貪夜蛾種類并不單一。

圖5 基于Tpi 基因標記的單倍型序列比對Fig.5 Haplotype sequence alignments based on Tpi gene marker

3 結論與討論

本研究采集了入侵廣州市的草地貪夜蛾樣本，利用基于COI和Tpi基因片段的分子標記進行了寄主型的鑒定?；贑OI-A、COI-B 和COI-C 標記的鑒定結果均顯示入侵廣州的草地貪夜蛾寄主單倍型為水稻型，與實際采集寄主不相符，可能原因是該標記不適合于檢測入侵廣州的草地貪夜蛾群體。但基于COI-A 的標記能夠區(qū)分草地貪夜蛾與其他近源種的基因型，為研究入侵草地貪夜蛾的田間行為和擴散提供豐富的信息。而COI-B 和COIC 只鑒定到1 種單倍型。COI-A 和COI-B 標記事實上擴增的是COI基因的同一片段，差別在于COI-A 標記擴增的片段較小，且使用的是簡并引物。因此，COI-A 標記具有比COI-B 標記和COIC 標記更強的鑒別能力。

Tpi基因標記的鑒定結果顯示入侵廣州的草地貪夜蛾寄主型為玉米型，與實際采集的寄主一致?；赥pi基因標記，入侵廣州的草地貪夜蛾群體被檢測到具有2 種單倍亞型，在該片段第126 和第127 位堿基具有RW 雜合。先前報道的入侵云南的群體只有一種單倍型[12]，說明草地貪夜蛾可能在擴散的過程中出現(xiàn)遺傳雜交現(xiàn)象。

草地貪夜蛾是聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預警的跨國界遷飛性重大害蟲。目前，入侵我國的草地貪夜蛾主要為害玉米，未見在水稻上定殖為害。華南地區(qū)是我國水稻主產(chǎn)區(qū)，應慎重評估草地貪夜蛾為害水稻的風險。對于“玉米型”和“水稻型”的區(qū)分，僅依靠個別基因的片段進行評估是不全面的[6]?；谖⑿l(wèi)星標記的分子指紋分析可以較全面地了解草地貪夜蛾的遺傳結構動態(tài)變化規(guī)律[17]。獲得與寄主取食相關基因的信息進而開發(fā)基因功能性分子標記，是精準鑒定草地貪夜蛾寄主單倍型的前提[18]。