韓曉亮，馮松林，孫彥闊，王衡，張桂紅

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，廣東廣州510642；3廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣東廣州510642)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種以母豬繁殖障礙和各種生長階段豬的呼吸系統(tǒng)疾病為特征的病毒性傳染病，俗稱“豬藍(lán)耳病”，其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine rep roductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[1-2]。PRRS于20世紀(jì)80年代末首先在美國被發(fā)現(xiàn)，臨床上主要表現(xiàn)為母豬晚期繁殖障礙和新生仔豬的呼吸道疾病[3]。隨后該病相繼在北美、歐洲、亞洲的養(yǎng)豬國家廣泛流行，并引發(fā)了空前的“流產(chǎn)風(fēng)暴”[4]，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2006年，在我國南方部分省份出現(xiàn)的“豬無名高熱”病，經(jīng)鑒定其病原為以JXA 1株為代表的高致病性PRRSV，引發(fā)了嚴(yán)重的PRRS疫情[5-6]。在PRRSV 的遺傳進(jìn)化樹中，HP-PRRSV 和之前流行的經(jīng)典毒株同屬于Lineage 8，其重要特征是Nsp2編碼區(qū)存在30個不連續(xù)氨基酸的缺失[7-8]，這種新出現(xiàn)的毒株具有毒力強(qiáng)、致死率高、傳播速度快等特點，至今依然是國內(nèi)流行的優(yōu)勢毒株[9]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成非常嚴(yán)重的損失。

反向遺傳學(xué)技術(shù)是研究RNA 病毒的有力工具，該技術(shù)通過對相關(guān)病毒基因進(jìn)行直接改造后構(gòu)建出病毒的感染性克隆，并經(jīng)RNA-launched 和DNA-launched 2種途徑對病毒進(jìn)行拯救[10-11]。RNA-launched 途徑是RNA 病毒基因組先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著克隆到合適的轉(zhuǎn)錄載體上，通過克隆到T7或者SP6啟動子的下游，先在體外轉(zhuǎn)錄出病毒全長的基因組RNA，隨后將這些體外的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝出活的病毒粒子[12-13]。DNA-launched 途徑則是將經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的病毒cDNA 克隆到真核啟動子如CMV 啟動子的下游，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒不經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄，直接轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，利用宿主細(xì)胞的核功能轉(zhuǎn)錄出病毒基因組，進(jìn)而完成病毒粒子的包裝[14]。相比RNAlaunched 途徑，DNA-launched 途徑避開了體外轉(zhuǎn)錄步驟，不僅操作簡便，還降低了轉(zhuǎn)染過程中RNA 降解的風(fēng)險，使轉(zhuǎn)染的效率大大提高。目前，反向遺傳技術(shù)在研究PRRSV 的結(jié)構(gòu)與功能、致病機(jī)制以及研發(fā)新型疫苗等方面有著廣泛應(yīng)用[15-17]。

本研究運(yùn)用反向遺傳操作技術(shù)將HP-PRRSV JXA 1株的全基因組分段克隆至改造過的低拷貝載體pOKq 上，成功構(gòu)建了JXA 1株的全長感染性克隆。并采取基于DNA-launched 途徑成功獲得拯救的病毒，并對拯救病毒進(jìn)行生物學(xué)特性的分析。HPPRRSV 代表株JXA 1株反向遺傳平臺的構(gòu)建，為HP-PRRSV 后續(xù)的結(jié)構(gòu)功能探索、致病機(jī)理研究以及新型疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、毒株、細(xì)胞、抗體克隆載體p JET1.2購買自Therm o Fisher Scientific。由pOK 12改造具有多克隆位點的低拷貝載體pOKq、XH-GD全長感染性克隆質(zhì)粒、PRRSV 易感細(xì)胞Marc-145細(xì)胞、轉(zhuǎn)染用BHK-21細(xì)胞均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室保存。HP-PRRSV JXA1毒株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)田克恭教授惠贈。PRRSV N蛋白單克隆抗體購買自韓國金諾公司。FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗購買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑RNA 抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、高保真DNA 聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司。T4DNA 連接酶購自Thermo Fisher Scientific。DL2000 DNA marker、250 bp DNA ladder (Dye plus)、克隆菌感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α、克隆載體pMD18-T vecto r 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；D N A 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA 公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Biological Industries。胎牛血清購自Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自Am resco公司。

1.2 方法

1.2.1 全長cDNA 構(gòu)建方案與引物設(shè)計構(gòu)建方案：JXA 1毒株全長cDNA 的構(gòu)建見圖1。先將CMV、A 1、A 2片段融合，融合產(chǎn)物再與A 3片段連接，構(gòu)成A 片段。將D1片段和終止信號肽序列BGH片段融合構(gòu)成D片段，然后將D、C、B、A 共4個片段依次亞克隆到低拷貝載體pOKq 上。

圖1 JXA1毒株全長cDNA 克隆的構(gòu)建策略Fig.1 The strategy for construction of the full-length cDNA clone of JXA1 strain

根據(jù)GenBank 中收錄的PRRSV JXA1毒株全基因組序列，利用Oligo7.0軟件設(shè)計6對引物對病毒的全長基因進(jìn)行分段克隆，獲得A 1、A 2、A 3、B、C和D1段。同時以PRRSV XH-GD全長感染性克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增CMV 和BGH 片段。同時在擴(kuò)增A 1片段時引入1個沉默突變，將全基因組第510位堿基由A 突變?yōu)镚，引入遺傳標(biāo)記FseI，以便與親代病毒相區(qū)別。引物序列由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。各段引物的序列、擴(kuò)增片斷大小及引物名稱見表1。

1.2.2 JXA1毒株全基因組各片段的擴(kuò)增以XHGD全長感染性克隆質(zhì)粒為模板，分別用引物(CM V-F、CM V-R)和(BGH-F、BGH-R)擴(kuò)增CMV 啟動子序列和BGH終止信號肽序列；按上海飛捷生物技術(shù)有限公司的RNA 抽提試劑盒操作說

明書提取JXA1細(xì)胞病毒的總RNA，用適量RNase free 水溶解，獲得總RNA，用SuperScriptTMIII 逆轉(zhuǎn)錄酶和OligodT(20)(Invitrogen，USA)，按照操作說明書進(jìn)行cDNA 合成，然后將獲得的cDNA 作為模板，用表1中擴(kuò)增引物進(jìn)行各片段的擴(kuò)增，經(jīng)過RTPCR，獲得A1、A2、A3、B、C 和D1片段，參照DNA purification kit 說明書純化擴(kuò)增的片段，利用融合PCR 技術(shù)，用引物(A 1-F、A2-R)融合A1和A 2片段，構(gòu)建點突變以引入全長感染性克隆的遺傳標(biāo)記FseI酶切位點，以回收的CMV 片段和A1、A2融合片段為模板，用引物(CMV-F、A 2-R)融合CM V、A 1、A 2片段并回收；以回收的BGH 片段和D1片段為模板，用引物(D 1-F、BGH-R)融合D 1和BGH片段構(gòu)成D片段并回收，PCR 按常規(guī)方法進(jìn)行，并設(shè)立空白對照。PCR 產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)電泳檢測并回收純化。另外，為了提高目的片段的保真性，構(gòu)建感染性克隆過程中的所有PCR 反應(yīng)均使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的PrimeSTAR?Max 高保真DNA 聚合酶。

表1 構(gòu)建JXA1株全長感染性克隆設(shè)計的引物序列Table 1 Primer sequencesused for construction of the full-length infectious clone of JXA1 strain

1.2.3 質(zhì)粒pOK-A、pJET-B、pJET-C 和pJET-D的構(gòu)建將CMV、A 1、A 2的融合回收產(chǎn)物連接到pOKq 空載體上形成載體pOK-CMV-A 1-A 2，再將擴(kuò)增的A 3片段連接到pOK-CMV-A 1-A 2載體上，構(gòu)建出pOK-A 中間載體。將D、C和B這3個片段的純化產(chǎn)物分別與pJET1.2載體連接。取5 μL的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α 后，用滅菌槍頭挑取可疑菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)4～6 h，取適量菌液進(jìn)行PCR 鑒定。將PCR 鑒定為陽性的菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗證。測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為p JET-B、p JETC和pJET-D，并按照OMEGA 公司的質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.4 JXA 1毒株全長cDNA 的構(gòu)建 將pJET-D、pJET-C、pJET-B和pOK-A 按照圖1所示的順序依次亞克隆到pOKq 載體，構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定為陽性的重組菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pOKJXA 1，并參照OMEGA 公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提。

1.2.5 JXA1株病毒的拯救將JXA 1株病毒全長cDNA 的重組質(zhì)粒pOK-JXA 1轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染使用Lipo fectam ine 3000(后文簡稱Lipo 3000)脂質(zhì)體，具體操作步驟參照說明書。轉(zhuǎn)染72 h后，將6孔板反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞液，4℃、7 000 r/m in 離心7m in，取上清接種于單層M arc-145細(xì)胞，吸附1 h 后補(bǔ)加含2%(φ)FBS的DMEM，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況(Cytopathic effect，CPE)，出現(xiàn)病變后凍融收毒，連續(xù)傳12代。將拯救的病毒命名為rJXA1。

1.2.6 拯救病毒的鑒定為驗證所看到的細(xì)胞病變是拯救病毒所致，排除親本病毒污染的可能，利用引入的沉默突變FseI酶切位點進(jìn)行鑒定。取第3代的病毒細(xì)胞培養(yǎng)懸液進(jìn)行總RNA 的提取，再取2 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA 為模板，以A 1-F和A 2-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，將純化后的PCR 產(chǎn)物送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

同時將拯救病毒的第3代rJXA 1-P3和親本病毒的第3代JXA 1-P3接種至長滿單層的M arc-145細(xì)胞6孔板中并設(shè)1孔陰性對照，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后對拯救的病毒進(jìn)行間接免疫熒光(Indirect imm unofluoresence assay，IFA)試驗鑒定。

1.2.7 拯救病毒的穩(wěn)定性將拯救病毒rJXA 1在M arc-145細(xì)胞上連續(xù)傳至12代，觀察每一代的CPE情況。同時從拯救獲得的病毒中，選擇第1、3、6、9和12代病毒進(jìn)行TCID50測定。將M arc-145細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時，將獲得的相應(yīng)代次的拯救病毒進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，即用DM EM進(jìn)行10?1～10?8倍比稀釋，分別接種于Marc-145細(xì)胞中，每個稀釋度接種8孔，每孔100μL。同時設(shè)未接毒的空白對照，將細(xì)胞板放置37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱作用90 min。棄去病毒液，加入含2%(φ)FBS的DMEM，放置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱。連續(xù)觀察2～7 d，記錄每個稀釋度細(xì)胞病變的孔數(shù)，本試驗重復(fù)3次求其平均值，并按照Reed-Muench 法計算各個樣品的TCID50。

1.2.8 拯救病毒的生長曲線測定rJXA 1第3代病毒和親本病毒JXA1第3代病毒在Marc-145細(xì)胞中的生長曲線。將rJXA 1第3代病毒和親本病毒JXA 1第3代病毒用DMEM培養(yǎng)基稀釋至感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為0.1，接種于長成單層的M arc-145細(xì)胞，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中孵育1 h，每個病毒各做3次重復(fù)。孵育結(jié)束后棄去上清，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入5mL含2%(φ)FBS的DMEM細(xì)胞維持液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于接種病毒12、24、36、48、60、72、84 和96 h后，從每瓶細(xì)胞中吸取200μL上清，然后測定各時相上清中病毒的TCID50，繪制病毒的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 JXA1毒株全基因組各片段的擴(kuò)增

以XH-GD全長感染性克隆質(zhì)粒為模板擴(kuò)增CMV 啟動子序列和BGH 終止信號肽序列，以JXA1反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板擴(kuò)增JAX 1的A 1、A 2、A 3、B、C 和D1段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見相應(yīng)的目的條帶，其中CMV、BGH 和A 1片段的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別約為750、500和500 bp，與預(yù)期大小相符(圖2A)。A2、A3、B、C和D1片段的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別約為2 200、3 000、3 000、2 700和3 300 bp，與預(yù)期大小相符(圖2B)。

圖2 JXA1株各基因片段的PCR 擴(kuò)增與構(gòu)建Fig.2 PCR amplification and construction of each gene fragment of JXA1 strain

利用融合PCR 技術(shù)融合A1和A2片段，構(gòu)建點突變來引入全長感染性克隆的遺傳標(biāo)記FseI 酶切位點，以回收的CMV 片段和A 1、A 2融合片段為模板，對CMV、A1、A2片段進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增并回收，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見約為3 800 bp擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖2C)。將CMV、A1、A2的融合回收產(chǎn)物連接到pOKq 空載體上形成載體pOK-CMV-A 1-A 2，再將擴(kuò)增的A3片段連接到pOK-CMV-A 1-A 2載體上，并進(jìn)行菌液PCR 鑒定(圖2C)，構(gòu)建出pOK-A 中間載體；以回收的BGH 和D1段為模板，對D1和BGH 片段進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增并回收，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見約為3 800 bp擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖2B)，然后將D、C、B片段依次克隆到pJET1.2載體上。

2.2 JXA1毒株全長cDNA 的構(gòu)建與鑒定

將pJET-D、pJET-C、pJET-B和pOK-A 按照圖1所示的順序依次連接到pOKq 載體，構(gòu)建全長cDNA的重組質(zhì)粒pOK-JXA1，用引物CMV-F、A1-R 對重組質(zhì)粒pOK-JXA 1進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見約為1 300 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符(圖3)，鑒定陽性的重組菌液送往上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pOK-JXA1。

圖3 pOK-JXA1菌液PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of pOK-JXA1 bacterial liquid

2.3 JXA1株病毒的拯救

將質(zhì)粒pOK-JXA1轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞72 h 后，凍融收獲病毒，離心取上清后接種至Marc-145細(xì)胞，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，顯微鏡下可見與親本病毒JXA1 類似的CPE(圖4)，將拯救病毒命名為rJXA1。

圖4 拯救病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變Fig.4 Cytopathic effect (CPE)produced in the rescued viruses

2.4 拯救病毒的鑒定

將拯救獲得的rJXA1在Marc-145細(xì)胞中連續(xù)傳代。取第3代病毒(rJXA 1-P3)的培養(yǎng)液抽提RNA 進(jìn)行RT-PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可檢測到強(qiáng)陽性條帶，大小與預(yù)期相符(圖5)。將純化的PCR 產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果顯示拯救病毒rJXA 1全基因組的第510位核苷酸由A 突變?yōu)镚，對應(yīng)的閱讀框由AGA 變?yōu)锳GG，推導(dǎo)的氨基酸均為精氨酸，產(chǎn)生了新的酶切位點FseI(GGCCG GCC)，與預(yù)期結(jié)果一致，表明拯救病毒的遺傳標(biāo)記被成功引入。

圖5 拯救病毒的遺傳標(biāo)記位點RT-PCR 鑒定Fig.5 Identification of genetic marker of the rescued virus by RT-PCR

用PRRSV N 蛋白單克隆抗體對親本病毒以及拯救病毒進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示：接種親本病毒和拯救病毒的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光，而陰性對照細(xì)胞沒有熒光產(chǎn)生(圖6)，證明病毒拯救成功。

2.5 拯救病毒的穩(wěn)定性

將拯救病毒rJXA1在Marc-145細(xì)胞上連續(xù)傳至12代，每一代均可以產(chǎn)生明顯CPE。圖7為第1、3、6、9和12代的細(xì)胞病變情況。同時對第1、3、6、9和12代病毒進(jìn)行TCID50的測定，結(jié)果表明，拯救病毒可在M arc-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，病毒滴度介于106.0～107.3TCID50/mL。

2.6 拯救病毒的生長曲線

對拯救病毒rJXA 1的第3代病毒和親本病毒JXA 1的第3代病毒進(jìn)行生長曲線的測定，結(jié)果表明拯救病毒rJXA 1第3代和親本病毒JXA 1第3代的生長曲線相似，二者達(dá)到最高滴度的時間相同，均為72 h(圖8)。

圖6 拯救病毒的間接免疫熒光鑒定Fig.6 Identification of the rescued virus through indirect immunofluoresenceassay

圖7 rJXA1在M arc-145細(xì)胞中引起的細(xì)胞病變Fig.7 Cytopathic effect (CPE)induced by rJXA1 in M arc-145 cells

圖8 拯救病毒和親本病毒的生長曲線Fig.8 The growth curves of the rescued virus and parental virus.

3 討論與結(jié)論

2006年以來，以感染豬高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征在我國爆發(fā)，并在全國范圍流行。截至目前，該病依然在國內(nèi)廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18]。

PRRSV 基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長15 kb左右。構(gòu)建其全長感染性克隆時需要避免基因突變、缺失等破壞保真性的情況出現(xiàn)。為克服這一難點，本研究在構(gòu)建過程中全程使用PrimeSTAR?Max 高保真聚合酶進(jìn)行基因的擴(kuò)增或融合PCR 擴(kuò)增。此外，為了避免長片段擴(kuò)增導(dǎo)致的保真性降低，本研究還將整個病毒的基因組分為4個節(jié)段分段克隆，逐步連接到嚴(yán)謹(jǐn)性較高的低拷貝載體pOKq 上，成功構(gòu)建了JXA 1株的全長感染性克隆。并采取基于DNA-launched 途徑進(jìn)行病毒拯救，成功構(gòu)建了HP-PRRSV JXA 1株的反向遺傳平臺，獲得了感染性拯救病毒rJXA 1。該拯救病毒與親本毒株JXA1具有相同的體外增殖能力。

為了區(qū)分親本病毒和拯救病毒，需要在拯救病毒的基因中加入遺傳標(biāo)記。本研究選擇了20株有代表性的基因II型PRRSV 毒株，使用M egA lign軟件對其進(jìn)行全基因組序列比對。最終選擇第510位堿基作為遺傳標(biāo)記位點。20株基因II型代表株在該位點的堿基均為A，對應(yīng)的氨基酸密碼子為AGA，編碼精氨酸，將其突變?yōu)镚 后不影響編碼的氨基酸，同時可以形成一個新的單酶切位點FseI(GGCCGGCC)，便于對拯救病毒和親本病毒的鑒定。

準(zhǔn)確且完整的全長感染性克隆的構(gòu)建是病毒拯救的關(guān)鍵[19]。本研究采取基于DNA-launched 途徑進(jìn)行病毒拯救，避開了RNA 體外轉(zhuǎn)錄的步驟，不僅減少了試驗操作的影響，也簡化了整個試驗流程。另外，本研究還在JXA 1病毒的基因組兩端添加了核酶序列，全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA，在核酶的作用下直接剪切，形成不含外源基因的病毒基因組。PRRSV 基因組3′端存在1個ploy A 尾，ploy A 的個數(shù)對病毒轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性有重要作用，如果ploy A 尾上A 的個數(shù)過少，有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失敗，無法產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子?；趶V東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室以前建立RNA-launched 反向遺傳平臺時的經(jīng)驗，本研究選擇了42個A 構(gòu)建病毒基因組的ploy A 尾。

雖然國內(nèi)已使用高致病性PRRSV 弱毒活疫苗來控制HP-PRRSV 的流行，但HP-PRRSV 毒株依然在國內(nèi)廣泛流行，未呈現(xiàn)明顯的減弱趨勢[20]，其他亞群(如NADC30-like 亞群和GM 2-like 亞群)呈現(xiàn)上升趨勢[21-22]，所以很有必要對其原因進(jìn)行研究。本研究成功構(gòu)建的HP-PRRSV JXA1株的反向遺傳平臺將為進(jìn)一步研究HP-PRRSV 的致病機(jī)理、基因功能以及新型疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，同時可為PRRSV 的防控提供技術(shù)參考。致謝：感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)田克恭教授惠贈HP-PRRSV JXA1毒株，感謝華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院陳耀博士在本研究的選題上給予的指導(dǎo)與建議！