浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

浙貝母（Fritillaria thunbergii，F(xiàn).thunbergii）為百合科多年生草本植物，以地下鱗莖入藥，是浙江省道地藥材“浙八味”之一[1]。浙貝母性味苦寒，有止咳化痰、清熱散結(jié)等多種功效，在抗炎、抗腫瘤、降血壓、抗氧化等方面具有顯著的藥理活性[2]。然而，長(zhǎng)期種植后容易出現(xiàn)連作障礙，不僅影響了浙貝母的品質(zhì)及產(chǎn)量，還會(huì)隨著致病菌的大量增加，從而導(dǎo)致根腐病等引起鱗莖腐爛[1]，限制了可持續(xù)性發(fā)展。為解決此問(wèn)題，種植中往往采用套種的方法。套種是一種在收獲第二季作物之前將另一種作物種植到第二季作物株行間的方法[3]。迄今為止，跟浙貝母套種的作物種類比較廣泛，如油葵、玉米、甘蔗、四季豆、黃瓜、生姜，西瓜等。實(shí)踐表明，套種不僅能夠提高浙貝母品質(zhì)及產(chǎn)量，還能防止浙貝母越夏期間種鱗腐爛，確保種苗數(shù)量，改善種苗品質(zhì)[4-6]。雖然與浙貝母套種的作物種類較多，但不同的套種方式對(duì)浙貝母品質(zhì)和產(chǎn)量的改善結(jié)果有所差異，其具體機(jī)制目前未知。

研究證實(shí)，套種能提高土壤肥力及土地使用率，使得作物產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)積累以及生物活性有所提升[7]。植物的生長(zhǎng)受到許多因素的影響，包括土壤結(jié)構(gòu)組成、pH、水分、光照、菌落等。在眾多影響因素中，土壤中不僅含有植物所需的營(yíng)養(yǎng)成分，還含有高豐度及巨大多樣性的微生物群落[8]。植物與微生物之間的互作是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因素，介導(dǎo)了植物生理和病理過(guò)程[9]。土壤微生物的拮抗作用、對(duì)于植物自身代謝的影響以及協(xié)助植物抵抗非生物壓力刺激的作用，介導(dǎo)了植物物理及化學(xué)性狀的改變[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)探討不同套種方式下植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，結(jié)合土壤功能基因豐度差異展開(kāi)深入分析，以了解套種對(duì)于浙貝母生長(zhǎng)潛在的調(diào)節(jié)作用和微生態(tài)機(jī)制。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 以浙江磐安為實(shí)驗(yàn)基地，實(shí)驗(yàn)分5組，每組20株設(shè)置組別：A組即對(duì)照組（浙貝無(wú)套種）、B組（浙貝套種玉米）、C組（浙貝套種生姜）、D組（浙貝套種黃瓜）、E組(浙貝套種西瓜）。待浙貝成熟后收獲，同時(shí)以5點(diǎn)采樣法同時(shí)采收浙貝母根際土（粘附于浙貝母鱗莖周圍2cm范圍內(nèi)定義為根際土）500g，過(guò)20目篩去除石塊以及動(dòng)植物殘?bào)w后裝入密封袋中，放入冰盒中保存，實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2 浙貝平均干重、貝母素甲以及貝母素乙含量的測(cè)定 將收集的浙貝鱗莖洗凈，曬干至恒重后用稱量天平稱量其干重。同時(shí)將收集的浙貝打粉，樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約2.000g，加濃氨試液4mL浸潤(rùn)1h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4:1）的混合液40mL，稱定重量，混勻，置80℃水浴中加熱回流2h。分別精密吸取對(duì)照品溶液 6μL、10μL、15μL，供試品溶液 5~15μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算貝母素甲、貝母素乙的含量。

1.3 土壤總基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序土壤樣品預(yù)處理后，利用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega公司產(chǎn)品，批號(hào)：00M5635020000C02Q003）進(jìn)行土壤總基因組DNA提取，具體方法詳見(jiàn)E.Z.N.ASoil DNA Kit的使用說(shuō)明書(shū)，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒（Life公司產(chǎn)品，批號(hào)：1759393）對(duì)基因組DNA精確定量，以確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chin Reaction,PCR）中應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物，其中341F 引物 5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’；805R 引物：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT-ACHVGGGTATCTAATC-3’。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件：第1輪PCR，94℃預(yù)變性3min，前 5 個(gè)循環(huán)，94℃變性 30s，45℃退火 20s，65℃延伸 30s；后 20個(gè)循環(huán)，94℃變性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；第2輪擴(kuò)增過(guò)程引入Illumina橋式PCR兼容引物，95℃預(yù)變性30s，共 5個(gè)循環(huán)，94℃變性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP，批號(hào)：14403400）行 DNA 純化回收，利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA進(jìn)行精確定量。每個(gè)樣品DNA量取10ng，上機(jī)進(jìn)行Miseq測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（sequenced reads）。去除引物接頭序列，再根據(jù)配對(duì)末端（paired-end，PE）reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對(duì)各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。使用Usearch去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列，而后對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤校正，并調(diào)用uchime鑒定嵌合體，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)代表性序列進(jìn)行blastn比對(duì)，剔除掉低于閾值的比對(duì)序列。利用 Usearch、vegan、mothur、PICRUSt等軟件進(jìn)行樣本多樣性分析、聚類及功能預(yù)測(cè)分析，繪制樣本聚類圖、群落結(jié)構(gòu)組分圖、功能豐度熱圖、豐度柱狀圖等，并進(jìn)行主成分分析/非度量多維尺度分析（primary component analysis/non-metric multi-dimensional scaling,PCA/NMDS）法進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)功能分類豐度在樣本之間的差異，利用元基因組譜的統(tǒng)計(jì)分析(Statistical Analysis of Metagenomic Profiles,STAMP)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)篩選樣本組間的差異功能分類單元，采用方法為Welch’s t-test。最后將檢驗(yàn)得到的P值采用FDR行Multiple test correction得到Q值。其余數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)將豐度大于10%的細(xì)菌門定義為優(yōu)勢(shì)門，豐度大于3%的細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢(shì)屬[13]。

2 結(jié)果

2.1 浙貝產(chǎn)量及有效成分含量 對(duì)各組浙貝樣本進(jìn)行稱量并計(jì)算平均干重，結(jié)果表明對(duì)照組浙貝的平均干重最低，僅為5.316g。各套種組浙貝平均干重均高于對(duì)照組，其中以生姜套種組的平均干重最高，為7.875g。套種處理后浙貝中貝母素甲以及貝母素乙的百分含量較對(duì)照組有所提升，其中黃瓜套種組的提升最大。但由于各組平均干重的差異，因此各組貝母素甲以及貝母素乙的絕對(duì)含量差異較大，其中生姜套種組貝母素甲絕對(duì)含量最高，達(dá)53mg，而黃瓜套種組的貝母素乙絕對(duì)含量最高，為2.6mg。見(jiàn)表1及圖1。

2.2 樣本相似度分析主成分分析（principal component analysis，PCA） 結(jié)果表明，在PCA1貢獻(xiàn)率49.5%，PCA2貢獻(xiàn)率26.35%的條件下，對(duì)照組遠(yuǎn)離其余各組，表明對(duì)照組與各套種組之間樣本的細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異較大。見(jiàn)圖2。而Alpha多樣性分析結(jié)果表明，對(duì)照組與玉米套種組的細(xì)菌多樣性最低，生姜、黃瓜以及西瓜套種組的細(xì)菌多樣性較高。見(jiàn)表2。

表1 不同套種方式浙貝產(chǎn)量及有效成分含量Tab.1 Yield and active ingredient content of F.thunbergii in different intercropping manners

圖1 浙貝產(chǎn)量及有效成分含量柱狀圖Fig.1 Yield and active ingredient content of F.thunbergii

2.3 細(xì)菌群落分析 對(duì)浙貝母根際細(xì)菌在分類水平上進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出39門、77綱、103目、246科、956屬。在97%的相似水平對(duì)各樣本進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，共檢測(cè)出運(yùn)算的分類單位（operational taxonomix unit,OTU）數(shù)目21976條，各樣品之間相似度為62.7%。共有的OTU為219條，約占各樣品總量的50.3%～67.8%。各組細(xì)菌種類構(gòu)成情況相似，但細(xì)菌種類所占比例有一定差異。門水平豐度前10的菌群占細(xì)菌總量的95.7%，分別為變形菌門（47.5%）、酸桿菌門（15.4%）、擬桿菌門（8.2%）、放線菌門（6.2%）、厚壁菌門（5.0%）、疣微菌門（4.4%）、浮霉菌門（3.6%）、芽單胞菌門（2.6%）、綠彎菌門（1.6%）、未分類菌門（1.2%）。其中變形菌門、酸桿菌門為優(yōu)勢(shì)門。經(jīng)套種處理后，變形菌門以及芽孢桿菌門相對(duì)豐度下降（P＜0.05），但酸桿菌門、放線菌門以及浮霉菌門的相對(duì)豐度都表現(xiàn)為升高。各樣品在門水平上的細(xì)菌群落分布見(jiàn)表3及圖3。

圖2 PCA主成分分析圖Fig.2 PCA principal component analysis

表2 浙貝母根際土壤樣本中細(xì)菌Alpha多樣性Tab.2 Bacterial Alpha diversity in rhizosphere soil of F.thunbergii

表3 不同套種方式浙貝母根際細(xì)菌門水平豐度前10位（%）Tab.3 Top ten(%)abundance of rhizobacteria in phylum level of F.thunbergii in different intercropping manners

屬水平上相對(duì)豐度最大的為未分類菌，占14.6%，其余按豐度大小排名依次為鞘氨醇單胞菌屬（4.5%）、Gp6屬（3.0%）、Gp1屬（2.8%）、芽單胞菌屬（2.6%）、放線菌屬（2.4%）、副球菌屬（2.3%）、微小桿菌屬（2.3%）、Gp2屬（2.1%）、Subdivision3屬（2.0%），共占細(xì)菌總量38.5%。其中未分類菌屬（14.6%）、鞘氨醇單胞菌屬（4.5%）以及Gp6屬（3.0%）為優(yōu)勢(shì)屬。經(jīng)套種處理后，芽單胞菌屬與鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度下降，而Gp1屬、Gp2屬及副球菌屬相對(duì)豐度明顯升高。此外，套種處理還提高了放線菌屬的相對(duì)豐度，各套種組與對(duì)照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。值得注意的是，生姜套種組中Gp1屬、Gp2屬以及副球菌屬的相對(duì)豐度均為各組最高（P＜0.05），且具有較高水平的放線菌屬。屬水平上的細(xì)菌分布見(jiàn)表4及圖4。

表4 不同套種方式浙貝母根際細(xì)菌屬水平豐度前10位（%）Tab.4 Top ten(%)abundance of rhizobacteria in genus level of F.thunbergii in different intercropping manners

圖3 不同套種方式浙貝母根際土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig.3 Composition of community structure of rhizobacterial in phylum level of different intercropping manners of F.thunbergii

2.4 根際土壤細(xì)菌功能基因 相對(duì)豐度差異分析基于蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG）數(shù)據(jù)庫(kù)的宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)功能分析以及對(duì)應(yīng)16sPICRUSt預(yù)測(cè)功能分析根際細(xì)菌功能基因，將所得到的Unigenes經(jīng)COG功能分類后歸屬到4個(gè)功能屬性25個(gè)類別功能之中，分別為信息儲(chǔ)存與處理（17.62%）、代謝（37.40%）、細(xì)胞進(jìn)程及信號(hào)（24.92%）以及未表征功能方面（20.07%）。基于PI-CRUSt功能二級(jí)分類結(jié)果，利用Welch’s t檢驗(yàn)比較組間豐度差異。在25個(gè)類別功能之中，對(duì)照組與各套種組在細(xì)胞壁/膜及內(nèi)源物質(zhì)合成（6.7%）、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成/轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝（2.5%）、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝（4.7%）以及防御機(jī)制（2.1%）方面功能基因豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各套種組中細(xì)胞壁/膜/內(nèi)源物質(zhì)來(lái)源、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成/轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝以及防御機(jī)制這四個(gè)方面的功能基因豐度均高于對(duì)照組（P＜0.05）。值得注意的是，生姜套種組中這4方面的功能基因豐度均為最高，與各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖4 不同套種方式浙貝母根際土壤細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig.4 Composition of community structure of rhizobacterial in genus level of different intercropping manners of F.thunbergii

圖5 基于COG的單種浙貝母與套種浙貝母之間根際土壤細(xì)菌功能基因豐度差異Fig.5 Differences in rhizobacterial functional genes abundance between single type and interplanted F.thunbergii based on COG database

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明套種能夠通過(guò)改變根際土壤微生物結(jié)構(gòu)來(lái)提高浙貝產(chǎn)量及品質(zhì)，但各組間具有一定差異。生姜、黃瓜、西瓜套種組的產(chǎn)量及有效成分含量較對(duì)照組以及玉米套種組的產(chǎn)量更高，同時(shí)也具有更高的細(xì)菌多樣性，其中GP1、GP2以及副球菌屬的含量明顯高于對(duì)照組和玉米套種組。玉米套種組不管從產(chǎn)量還是有效成分含量方面與對(duì)照組相比都無(wú)明顯差異，表明浙貝與玉米套種對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。利用Pearson相關(guān)性分析來(lái)分析各菌屬與浙貝產(chǎn)量以及有效成分含量之間的相關(guān)性，結(jié)果表明浙貝干重與GP1屬之間呈顯著相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)為0.890，P＜0.05）。雖然浙貝干重與GP2屬以及Subdivision3屬的相關(guān)性不顯著，但也具有較高的相關(guān)性（相關(guān)性系數(shù)分別為0.770、0.827），表明這兩種菌屬可能對(duì)浙貝生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。而放線菌則與貝母素甲和貝母素乙呈顯著相關(guān)（相關(guān)性系數(shù)分別為0.969、0.907，P＜0.05）。值得注意的是，雖然生姜套種組的貝母素甲以及貝母素乙含量百分比不是最高，但生姜套種組的產(chǎn)量為各組最高，且Gp1屬、Gp2屬以及副球菌屬的相對(duì)豐度均為各組最高（P＜0.05），表明與生姜套種對(duì)于浙貝生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。

研究表明，套種能夠提高貝母產(chǎn)量，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論[5-7]。在浙江磐安地區(qū)，將貝母與其他作物套種是提高浙貝母產(chǎn)量的普遍做法，其中玉米、生姜、黃瓜、西瓜等是與浙貝母套種最常用的作物。浙貝藥用部位為鱗莖，而根際則是植物根系周圍大量微生物趨向的熱點(diǎn)[14]。土壤中的植物生長(zhǎng)促進(jìn)微生物能夠通過(guò)生物肥料、根系調(diào)節(jié)等機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)[15-17]。經(jīng)套種處理后，細(xì)菌多樣性升高，其中GP1屬、GP2屬以及副球菌屬的相對(duì)豐度上升，且生姜套種組中這三種菌的相對(duì)豐度最高。而Gp1屬以及Gp2屬以及副球菌屬都與氮磷元素的代謝相關(guān),能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[18-19]。副球菌屬能夠產(chǎn)生鐵載體，水解酶和IAA，并溶解磷酸鹽[20]。Gp1以及Gp2屬于酸桿菌門，能夠促進(jìn)植物激素吲哚-3-乙酸的產(chǎn)生和鐵的吸收[21]。因此，套種可能通過(guò)提高氮磷代謝相關(guān)微生物的含量，使得根際中植物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度升高，從而有利于浙貝生長(zhǎng)，而與生姜套種可能是促進(jìn)貝母生長(zhǎng)最有利的方式。

浙貝母主要的土傳病害為根腐病及黑霉病，能夠引起貝母鱗莖的腐爛。本實(shí)驗(yàn)中，套種后土壤中放線菌相對(duì)豐度明顯上升，大約提高了19%～74%，其中生姜套種組提高了53%。研究表明，放線菌對(duì)于尖孢鐮刀菌具有拮抗活性，而尖孢鐮刀菌是貝母根腐病的主要致病菌[22]。此外，放線菌對(duì)于貝母黑腐病致病菌座盤菌也具有拮抗作用[23]。另有研究表明，小麥、玉米等作物可以釋放苯丙惡嗪類防御性次級(jí)代謝產(chǎn)物，并改變下一代根際相關(guān)微生物群落以及提高植物防御[24]。因此，生姜、黃瓜以及西瓜很可能通過(guò)分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)提高浙貝母根際放線菌等生防菌的含量，從而增強(qiáng)對(duì)于致病菌的防御能力。而生物堿是植物用于抵御病原微生物的重要物質(zhì)。最近的研究表明，細(xì)菌以及放線菌與生物堿含量之間具有相關(guān)性，可能參與了生物堿的合成[25]。本實(shí)驗(yàn)證明了放線菌與貝母素甲以及貝母素乙之間顯著的相關(guān)性，而貝母素甲以及貝母素乙是浙貝生物堿類物質(zhì)的藥效指標(biāo)成分。因此，套種可能通過(guò)提高土壤中細(xì)菌以及放線菌含量來(lái)促進(jìn)浙貝貝母素甲以及貝母素乙的合成從而增強(qiáng)其抗病能力。

基于PICRUSt功能二級(jí)分類結(jié)果，比較組間功能豐度差異發(fā)現(xiàn)，套種提高了細(xì)胞壁/膜/內(nèi)源物質(zhì)合成、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成/轉(zhuǎn)運(yùn)/代謝、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（代謝屬性）以及防御機(jī)制4個(gè)方面功能基因豐度，而生姜套種組中這4個(gè)方面的功能基因豐度均為最高。土壤微生物在代謝過(guò)程中往往會(huì)產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物，如抗生素、亞硝酸鹽等，這些化合物的產(chǎn)生都與代謝屬性的功能基因有關(guān)[26-27]。本實(shí)驗(yàn)中，生姜套種組中的GP1屬、GP2屬以及副球菌屬的相對(duì)豐度較其他套種組更高，同時(shí)也具有更高豐度的代謝屬性功能基因。因此我們推測(cè)，合成代謝方面的功能基因豐度增加可能與這三種細(xì)菌有關(guān)。雖然生姜套種組的放線菌含量不是最高，但卻具有最高豐度的防御功能基因，這可能是由于生姜套種組中還存在其他的生防菌，使得生姜套種組的防御能力優(yōu)于其他各組，而代謝以及防御方面功能基因豐度的提高則意味著根際代謝能力以及對(duì)于致病菌預(yù)防能力的增強(qiáng)。

套種是在浙貝母種植過(guò)程中經(jīng)過(guò)不斷實(shí)踐摸索出來(lái)的種植方式，對(duì)于浙貝連作障礙的改善作用已經(jīng)在長(zhǎng)時(shí)間的勞作實(shí)踐中被廣泛認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，套種能夠改變根際菌群結(jié)構(gòu)，提高細(xì)菌多樣性，增加植物生長(zhǎng)促進(jìn)微生物及生防菌的含量，從而提高浙貝產(chǎn)量和品質(zhì)。其中以生姜套種組的產(chǎn)量提升較大，而黃瓜與西瓜套種組的品質(zhì)提升較大。但結(jié)合藥效成分的絕對(duì)含量以及經(jīng)濟(jì)效益綜合來(lái)看，生姜是與浙貝套種的最優(yōu)選擇。