遆振宇，高小鵬，千東維，慕喜喜

（1.西安市第三醫(yī)院a.普外二科；b.手術(shù)室，西安 710018；2.西安市中心醫(yī)院普外二科 西安 710003）

膽管癌包括肝內(nèi)膽管上皮癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC）、膽囊癌（gallbladder carcinoma，GB ca）、肝外膽管上皮癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，EHCC）及肝胰管壺腹癌（ampulla of vater carcinoma，AoV ca），該類患者死亡率高，且預(yù)后差[1-4]。目前已證實(shí)腫瘤細(xì)胞具有免疫逃避功能，可以通過躲避機(jī)體免疫細(xì)胞的識(shí)別和攻擊，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖與擴(kuò)散[5-6]。與免疫相關(guān)的細(xì)胞主要有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及血小板，均發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力[7-8]。在腫瘤免疫治療中許多生物標(biāo)志物，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等與疾病的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[9]。細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed death-Ligand 1，PDL1）作 為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，是腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中一個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物[10]。有研究報(bào)道[11-13]，在腎細(xì)胞癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤中，外周血sPDL1過表達(dá)能削弱宿主免疫功能，導(dǎo)致較差的預(yù)后。因此，本文通過測(cè)定晚期膽管癌（biliary tract cancer，BTC）患者血清中sPDL1水平，探究sPDL1與中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞 比 值（neutrophil-to-lymphocyte patro，NLR）在BTC患者中生存預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年2月～2019年3月我院收治的、病理診斷為BTC且進(jìn)行姑息化療的患者144例，其中，男性90例，女性54例，平均年齡64.3±10.5歲。包括肝內(nèi)膽管上皮癌（IHCC） 63例、膽囊癌（GB Ca）51例、膽外膽管上皮癌（EHCC）18例及肝胰管壺腹癌（AoV Ca）12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為BTC且進(jìn)行姑息性化療的患者，無心功能不全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除具有其他慢性炎癥疾病者，嚴(yán)重肝腎功能損傷者，免疫系統(tǒng)低下者，主動(dòng)退出隨訪者。本研究經(jīng)得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTex，自動(dòng)化生化分析儀Siemens ADVIA2400購(gòu)自德國(guó)西門子公司，自動(dòng)化血液細(xì)胞分析儀BC6800購(gòu)自邁瑞公司。

表1 所有患者的基本資料及臨床癥狀分析[n(%)]

1.3 方法 收集患者第一次姑息化療前的血液標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)患者血清sPDL1含量，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定三次[11]。采用自動(dòng)化血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)總膽紅素（total bilirubin，TBil）、清 蛋 白（albumin，ALB）、癌 胚 抗 原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖 鏈 抗 原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA-19-9）水平和血細(xì)胞數(shù)目（中性粒細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞）。NLR和PLR由中性粒細(xì)胞和血小板及淋巴細(xì)胞數(shù)目計(jì)算所得。全身免疫炎癥指數(shù)（systemic immune inflammation index,SII）計(jì)算方法：中性粒細(xì)胞數(shù)×血小板數(shù)/淋巴細(xì)胞數(shù)量[14]。

采用隨機(jī)抽樣模式[15]將患者分為兩組：發(fā)展組和穩(wěn)定組?？偵鏁r(shí)長(zhǎng)數(shù)（overall survival, OS）：化療的第一天到死亡或者最后一次隨訪，OS的中值采用K-M模式計(jì)算。患者的生存狀態(tài)是通過國(guó)家死亡上報(bào)系統(tǒng)進(jìn)行判定。對(duì)于預(yù)測(cè)患者OS的變量sPDL1，NLR，PLR和SII的分界值確定，本文采用極小P值接近法進(jìn)行測(cè)定[25]，生物標(biāo)志物的分界值測(cè)定采用雙重交叉效度分析法[26]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，計(jì)量資料采用中位值及均數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)差 ）表示，利用q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素及多因素Cox回歸模型分析法分析患者的OS，來研究sPDL1，NLR，BTC患者生存預(yù)后的關(guān)系，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料及生存時(shí)長(zhǎng)比較 見表1。兩組患者的臨床資料（年齡、性別、原始病因、ALB，CEA和CA-19-9等）進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），所有患者持續(xù)隨訪96.3月，OS中值是9.12月。比較兩組患者的OS，發(fā)現(xiàn)發(fā)展組患者OS中值為8.34個(gè)月，穩(wěn)定組為10.25個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 免疫相關(guān)生物標(biāo)志物分界值的水平比較分析 見表2，表3。發(fā)展組與穩(wěn)定組的sPDL1分界值分別為2.91和1.01 ng/ml。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)患者的sPDL1分界值是可變的。NLR，PLR及SII的中值分別為2.58，141.78及583.95，分界值分別為3.48，88.72和573.56。另外發(fā)現(xiàn)IHCC患者sPDL1水平最高，而EHCC患者sPDL1水平最低。

表2 兩組患者宿主免疫相關(guān)生物標(biāo)志物水平比較

表3 兩組分界值的確定及比較

2.3 生存時(shí)長(zhǎng)對(duì)比分析 患者的sPDL1水平中值 為1.19（0.04～7.31）ng/ml，而 正 常 健 康 人 群SPDLT水平為1.19（0.03～2.32） ng/ml，兩者水平相同，故血清中sPDL1水平在健康人群與BTC患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，患者疾病程度不同，其sPDL1及NLR中值不同。sPDL1＜0.96 ng/ml的患者OS中值為16.65個(gè)月，而sPDL1≥0.96 ng/ml的患者為10.38個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.001）。同時(shí)，NLR＜3.48的患者OS中值為18.52個(gè)月，顯著長(zhǎng)于NLR≥3.48患者的OS中值（13.45個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。因此，sPDL1低水平患者表現(xiàn)出較長(zhǎng)的OS，表明sPDL1高水平會(huì)增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。NLR值低于分界值的患者表現(xiàn)出更長(zhǎng)的OS。

2.4 患者姑息化療后生存預(yù)后因素的分析 見表4。體力狀態(tài)、診斷、疾病程度（初始不能切除的或復(fù)發(fā)的）、轉(zhuǎn)移器官數(shù)量、低ALB及高CEA或CA-19-9是影響患者預(yù)后的因素。sPDL1，NLR和SII是影響患者的OS因素（P＜0.05）。多因素分析結(jié)果表明，sPDL1和NLR也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

表4 影響患者生存預(yù)后的因素分析

3 討論

腫瘤免疫學(xué)是腫瘤治療領(lǐng)域的一種新方法。特別是在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌中免疫檢查點(diǎn)抑制劑的成功運(yùn)用[16-17]。已證實(shí)預(yù)后較差的BTC患者主要在于其免疫檢查點(diǎn)和細(xì)胞因子的基因突變[18]。PDL1和程序化死亡受體1（PD1）作為其中的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在預(yù)后較差患者中水平顯著增高[19]。目前如果想評(píng)估腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的PDL1或PD1水平，需要足夠量的腫瘤組織。往往腫瘤患者的組織活檢是十分困難的，尤其是BTC患者，腫瘤細(xì)胞僅僅通過膽管進(jìn)行擴(kuò)散，所以獲取足夠的腫瘤組織是一個(gè)挑戰(zhàn)性難題。因此，進(jìn)行液體活檢或者液體生物標(biāo)志物檢查將是目前更好地選擇。本文對(duì)BTC患者血清中sPDL1水平進(jìn)行測(cè)定，分析其與姑息化療后患者生存預(yù)后的關(guān)系。采用ELISA測(cè)定BTC患者在姑息化療開始前血清中sPDL1 水平。發(fā)現(xiàn)sPDL1 表達(dá)水平可以在所有患者中測(cè)定，范圍為0.04～7.31ng/ml。在復(fù)發(fā)且具有較低腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中，sPDL1 水平顯著低于初始不能切除的腫瘤患者，且復(fù)發(fā)患者的OS較長(zhǎng)。另外，在四種不同病因的腫瘤患者中，IHCC患者的sPDL1 水平最高，OS最短（8.28個(gè)月）?？赡艿脑蚴?，PDL1主要在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中表達(dá)，能夠與活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞上表達(dá)的PD1相結(jié)合，起到免疫抑制作用[21]。當(dāng)PDL1與PD1結(jié)合后，抑制信號(hào)被激活，從而反饋給T細(xì)胞，起到負(fù)調(diào)節(jié)作用[22]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞也表達(dá)PDL1，激活抑制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)逃脫宿主免疫應(yīng)答。sPDL1 被證實(shí)能與陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞上的PD1結(jié)合，起到全身性免疫抑制作用[23-24]。然而，目前sPDL1 的確切功能還不十分清楚。

另一方面，已有研究證實(shí)NLR，PLR以及SII在實(shí)體瘤預(yù)后監(jiān)測(cè)中具有重要價(jià)值[20]。本研究發(fā)現(xiàn)高水平NLR，PLR以及SII的患者具有較短的OS。確定這些免疫標(biāo)志物的分界值后，證實(shí)NLR水平越高，患者預(yù)后越差，OS越短。

我們的研究存在一定局限性。首先本研究屬于回顧性的、寡中心的研究，雖然我們嘗試去驗(yàn)證這些標(biāo)記物的分界值，但發(fā)現(xiàn)這些應(yīng)該在本研究設(shè)計(jì)之前且不同獨(dú)立患者群中進(jìn)行驗(yàn)證。而且，關(guān)于sPDL1的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述， sPDL1 在BTC患者血清中的含量是可以測(cè)定的，高水平的sPDL1 是BTC患者姑息化療后生存預(yù)后的獨(dú)立因素。因此，sPDL1 可能是免疫腫瘤藥物研究的一種液體生物標(biāo)記物，具有重要臨床意義。