范林進(jìn)，王雨龍，吳甜甜，李 凱，姜 楠，高玉龍，高 立，劉長軍，崔紅玉，潘 青，張艷萍，劉玉鳳，孫先本，劉俊啟，王笑梅,4*，祁小樂*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150069；2.世界動(dòng)物衛(wèi)生組織傳染性法氏囊病參考實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069；3.法國詩華動(dòng)物保健公司，北京100102；4.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是雞的一種重要免疫抑制病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。其病原是IBD 病毒(IBDV)，其屬于雙RNA病毒科禽雙RNA 病毒屬，基因組包括兩條雙鏈RNA，即A、B 節(jié)段[1]。A 節(jié)段編碼4 個(gè)蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白VP2 和VP3，具有水解酶活性的VP4 以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，其中VP2 是IBDV 的衣殼蛋白和主要保護(hù)性抗原，與病毒的毒力、細(xì)胞嗜性和抗原變異有關(guān)[2-5]。VP2 的aa206～aa350 被稱為高變區(qū)(Hypervariable region，HVR)，常被用做 IBDV 的遺傳演化分析[6]。

IBDV 有兩個(gè)血清型，血清I 型主要引起雞發(fā)病，血清II 型對(duì)雞不致病。在過去的幾十年里，血清I 型IBDV 主要發(fā)生過兩次較大的變異，相繼出現(xiàn)了經(jīng)典株、變異株和超強(qiáng)株[1]。上世紀(jì)90 年代以來，以急性、高致死率為主要特征的IBDV 超強(qiáng)株(Very virulent IBDV，vvIBDV)席卷全球，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[7-8]。經(jīng)近30 年的努力，基于飼養(yǎng)管理水平的提高和疫苗的廣泛使用等因素，vvIBDV感染逐漸被控制。然而近年來IBD 出現(xiàn)了新變化，非典型IBD 在我國部分雞場相繼被發(fā)現(xiàn)，感染雞無明顯外觀癥狀，但其中樞免疫器官法氏囊卻嚴(yán)重萎縮，導(dǎo)致其嚴(yán)重免疫抑制和生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。2017 年，本實(shí)驗(yàn)室率先鑒定了該疫情的病原是IBDV 新型變異株[9]。本研究初步監(jiān)測了IBDV 新型變異株的流行情況，研究了其致病性，對(duì)IBD 的綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品 臨床樣品采集于2018 年9 月至2019 年6 月，共251 份法氏囊樣品，來自于黑龍江、遼寧、河北、山東、江蘇、浙江、云南共7 個(gè)省份的48 個(gè)肉雞群(表1)。發(fā)病雞主要為3 周齡～6周齡的免疫雞群，呈現(xiàn)亞臨床感染，但法氏囊組織嚴(yán)重萎縮，雞的免疫力和生產(chǎn)性能受到影響。采集的法氏囊組織用PBS 溶液制備成10 % (w/v)的混懸液，反復(fù)凍融3 次，于4 ℃、5 000 g 離心5 min，取上清進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 ExTaq酶、RNAiso Plus 均購自TaKaRa 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen 公司。IBDV 新型變異株參考毒株SHG19 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病團(tuán)隊(duì)(以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室)分離、鑒定和保存[9]。SPF 雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中。

1.3 IBDV VP2 基因高變區(qū)的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中IBDV 參考序列設(shè)計(jì)VP2 基因代表區(qū)段通用引物，上游引物P1：5'-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3'/下游引物 P2：5'-TCAGGATTTGGGATCAGC-3'，由吉林省庫美生物科技有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增長度為643 bp。取 1.1 制備的200 μL 病料混懸液上清，根據(jù)RNAiso Plus 說明書提取總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板，PCR擴(kuò)增VP2 基因片段，反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將同一雞群陽性樣品的RT-PCR 產(chǎn)物隨機(jī)選擇1～2 份由吉林省庫美生物科技有限公司測序。最終將所有病毒株的有效序列確定為558 bp (VP2 基因的547 bp～1 104 bp，對(duì)應(yīng)于aa183～aa368)，并上傳GenBank。該序列涵蓋了VP2 基因的高變區(qū)(A 節(jié)段的746 bp～1 180 bp，對(duì)應(yīng)于 VP2 基因的 616 bp～1 050 bp，VP2 蛋白氨基酸的aa206～aa350)。

1.4 序列分析 針對(duì)上述VP2 的558 bp 片段，利用軟件 Clustal X program (version 2.0)[10]和 MEGA(version 3.1)[11]對(duì)本研究鑒定的IBDV 進(jìn)行序列分析。本實(shí)驗(yàn)室 2017 年 9 月～2018 年 9 月鑒定的 50 株IBDV 新型變異株(表1)也基于該序列進(jìn)行分析。所用的其它參考株如下：早期變異株：Variant E(USA)(AF133904)、Variant A (USA) (M64285)、GLS (USA)(AY368653)、E Del (USA) (DD187400)、9109 (USA)(AY462027)； 超 強(qiáng) 毒 株 ： BD399 (Bangladesh)(AF362776)、 02015.1 (France) (AJ879932)、 D6948(Netherlands) (AF240686)、 Gx (China) (AY444873)、Harbin-1 (China) (AF092171)、 HLJ0504 (China)(GQ451330)、 HK46 (China) (AF092943)、 OKYM(Japan) (D49706)、UK661 (UK) (NC-004178)、YS07(China) (FJ695138)；弱毒株：CEF94 (Netherlands)(AF133904)、 CT (France) (AJ310185)、 CU-1 (Germany) (X16107)、 D78 (USA) (AF499929)、 Gt (China)(DQ403248)、HZ2 (China) (AF321054)、JD1 (China)(AF321055)、NB (China) (AY319768)、P2 (Germany)(X84034)；經(jīng)典株：IM (USA) (AY029166)；中毒力疫苗株：W2512 (MN218126)；血清 II 型病毒株：23/82(Germany)(AF362773)、OH(Canada)(U30818)。

1.5 IBDV 新型變異株動(dòng)物感染試驗(yàn)

1.5.1 IBDV 致病性檢測 選用IBDV 新型變異株SHG19 感染SPF 雞，進(jìn)行致病性試驗(yàn)。為了測定SHG19 的最小致病劑量，將28 日齡SPF 雞隨機(jī)分為4 組，每組10 只。將SHG19 原液10 倍倍比稀釋(8×104～8×106)后分別感染第 1、2、3 組雞，200 μL/只，感染途徑為點(diǎn)眼滴鼻。第4 組雞接種PBS(200 μL/只)作為空白對(duì)照。感染SPF 雞后逐日觀察雞的臨床癥狀。感染后第7 d 剖檢所有實(shí)驗(yàn)雞，觀察法氏囊的病變情況。稱量體重和法氏囊重量，計(jì)算囊重指數(shù)(bursa∶body-weight index，BBIX)。囊重比 =(法氏囊重/ 體重)×1 000；BBIX= 實(shí)驗(yàn)組雞囊重比 / 空白對(duì)照組雞平均囊重比；當(dāng)BBIX＜0.7 時(shí)，判為法氏囊萎縮[12]。每組隨機(jī)選取3 只雞的法氏囊組織樣品浸泡在10 %福爾馬林溶液中，經(jīng)HE 染色后，觀察其病理變化。

1.5.2 法氏囊半數(shù)萎縮量(50 % buysae atrophy dose,BAD50)的測定 在1.5.1 的試驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)感染后第7 d每個(gè)感染組的法氏囊萎縮的雞數(shù)，采用Reed-Muench[13]法計(jì)算該病毒的BAD50。

2 結(jié)果與討論

2.1 IBDV VP2 基因高變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果 本研究利用1.3 中RT-PCR 共檢測了來自于7 個(gè)省的疑似非典型IBD 的251 份法氏囊病料，結(jié)果顯示雞群IBDV 陽性率為77.08%(37/48)，病料IBDV 陽性率為68.53%(172/251)。最終經(jīng)測序確定了32 株IBDV 株的VP2基因高變區(qū)序列，GenBank 登錄號(hào)見表1。

2.2 序列分析結(jié)果 基于VP2 基因高變區(qū)的氨基酸序列進(jìn)化樹顯示，血清I 型IBDV 明顯分為經(jīng)典株、超強(qiáng)株、減毒株和變異株4 個(gè)分支；本研究的32 株IBDV 處于變異株分支(圖1)?；赩P2 基因高變區(qū)核苷酸序列的同源性分析顯示，IBDV 新型變異株與美國早期變異株的同源率為91.4%～94.8%(除了GLS 株)，而與經(jīng)典株、超強(qiáng)株、減毒株的同源率分別為89.8%～91.9%、87.6%～91.0%、88.9 %～91.9 %。在VP2 高變區(qū)中，本研究的32 株IBDV具有變異株特征性氨基酸222T、249K、286I 和318D[14-15]。表明非典型IBD 的病原是IBDV 變異株。

在進(jìn)化樹中，IBDV 變異株分為兩個(gè)明顯的亞群，美國早期變異株為一個(gè)亞群，本研究的32 株IBDV 與本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的IBDV 新型變異株形成了另一個(gè)亞群(圖1)。IBDV 新型變異株之間的VP2基因高變區(qū)核苷酸序列的同源率為95.1 %～100 %，而與美國早期變異株的同源率僅為91.4 %～94.8 %(除了 GLS 株)。另外，IBDV 新型變異株的 VP2 高變區(qū)存在3 個(gè)不同于美國早期變異株的獨(dú)特氨基酸(221K、252I 和299S)。表明我國新流行的IBDV 變異株屬于IBDV 新型變異株。

本研究的32 株IBDV 新型變異株涵蓋了黑龍江、遼寧、河北、山東、江蘇、浙江、云南全部7個(gè)被檢測省份。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果，已經(jīng)在我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、北京、山東、山西、福建、江蘇、安徽、湖北、浙江、云南等至少13 個(gè)省(市)檢測到了IBDV 新型變異株的流行，發(fā)病雞主要是25 日齡以上的肉雞。這提示IBDV 新型變異株正在我國不斷蔓延。

表1 IBDV 新型變異株的背景信息Table 1 Background information of IBDV novel variant strains

IBDV 變異株最早于上世紀(jì)80 年代末出現(xiàn)于美國，隨后其在美國流行的報(bào)道一直沒有間斷，而且成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的優(yōu)勢IBDV 株，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。IBDV 變異株于上世紀(jì)90 年代初在包括中國在內(nèi)的其它國家也有零星發(fā)現(xiàn)，但隨后鮮見流行的報(bào)道。最近我國IBDV 新型變異株的鑒定是近30 年來亞太地區(qū)關(guān)于IBDV 變異株較大范圍流行的首次報(bào)道[9]。IBDV 新型變異株的起源尚無定論。有人認(rèn)為是源于免疫壓力下的野毒株的突變或重組；有人認(rèn)為類似病毒株早就存在，只是由于人們長期以來過度關(guān)注vvIBDV 而在監(jiān)測上被“忽視”了[18]。具體原因尚待進(jìn)一步研究。

圖1 IBDV VP2 高變區(qū)氨基酸序列進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of HVR amino acid sequence of IBDV VP2 gene

2.3 IBDV 新型變異株動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果 和空白對(duì)照組一樣，SHG19 不同劑量感染的3 個(gè)組SPF雞，均未觀察到明顯外觀癥狀。感染后第7 d 剖檢發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，8×104和8×105兩個(gè)稀釋劑量組SPF 雞的法氏囊呈現(xiàn)明顯萎縮，質(zhì)地變硬，BBIX 分別為 0.322±0.045 和 0.342±0.070；8×106稀釋劑量組SPF 雞法氏囊大小正常，BBIX 為1.077±0.209 (圖2A 和2B)。組織病理學(xué)切片顯示，SHG19感染組萎縮的法氏囊中濾泡結(jié)構(gòu)受到破壞，淋巴細(xì)胞顯著減少，個(gè)別濾泡髓質(zhì)可見少量異嗜細(xì)胞浸潤，局部成纖維細(xì)胞增生，對(duì)照組無明顯病理變化(圖2C)。

IBDV 新型變異株引起的非典型IBD 的危害不容忽視。一方面，IBDV 新型變異株雖然不致死雞，但卻造成雞中樞免疫器官法氏囊嚴(yán)重萎縮，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，易繼發(fā)和并發(fā)其它疫病。另一方面，IBDV 新型變異株會(huì)干擾其它重要疫病疫苗的免疫效果。前期研究數(shù)據(jù)顯示，IBDV 新型變異株的感染嚴(yán)重干擾了禽流感H5/H7 二聯(lián)疫苗的抗體產(chǎn)生[9]。再者，IBDV 新型變異株的感染嚴(yán)重影響增重等生產(chǎn)性能[9]。

前期研究顯示，IBDV 新型變異株在CEF、DF1等細(xì)胞中不能產(chǎn)生細(xì)胞病變，對(duì)雞胚的致病性也較弱，無法采用傳統(tǒng)的TCID50(50 % tissue culture infective dose)或 ELD50(50 % embryo lethal dose)進(jìn)行病毒效價(jià)的測定，這在一定程度上限制了對(duì)該病的進(jìn)一步研究。系統(tǒng)的致病性研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊萎縮是IBDV 新型變異株感染雞的一個(gè)具有重要示病意義的癥狀，本研究首次提出了BAD50的概念，即能造成半數(shù)雞的法氏囊萎縮的病毒感染劑量。用10 倍比稀釋的IBDV 變異株感染28 日齡SPF 雞，每個(gè)稀釋度10 只雞，感染后第7 d 剖檢，依據(jù)BBIX 統(tǒng)計(jì)各組雞的法氏囊萎縮數(shù)，采用Reed-Muench[13]法計(jì)算病毒的BAD50。本研究對(duì)IBDV 新型變異株SHG19的 BAD50測定結(jié)果顯示，8×104和 8×105稀釋劑量組的10 只雞法氏囊全部萎縮，8×106稀釋劑量組的10只雞法氏囊均正常(圖2A 和 2B)，計(jì)算出本批SHG19 的效價(jià)為 1.26×106BAD50/100 μL。

圖2 IBDV 新型變異株的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)Fig.2 Animal infection experiment of novel variant strains of IBDV

值得注意的是，本研究的IBDV 新型變異株均是在免疫雞群中檢測到的，這提示針對(duì)vvIBDV 的現(xiàn)有疫苗可能不能對(duì)IBDV 新型變異株提供完全保護(hù)。前期研究發(fā)現(xiàn)，與vvIBDV 及其減毒疫苗株相比，IBDV 新型變異株具有完全不同的單克隆抗體反應(yīng)譜特征[9]。IBDV 新型變異株的分子流行病學(xué)、遺傳變異機(jī)制、免疫抑制機(jī)制以及對(duì)疾病的有效防控措施亟需深入研究。