江懿佳 王青青 劉 楊

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，杭州 310058)

淋巴細(xì)胞活化受共刺激分子和共抑制分子共同調(diào)節(jié)，這些抑制性分子稱為免疫檢查點(diǎn)，即免疫系統(tǒng)活化保持在正常范圍之內(nèi)的關(guān)鍵點(diǎn)[1]。T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)上的抗原肽——主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)復(fù)合物，與此同時(shí)T細(xì)胞共刺激分子CD28與APC上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)相互作用，提供共刺激信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞活化[2]。在早期T細(xì)胞活化中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)作為免疫檢查點(diǎn)，直接與CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD80和CD86下調(diào)免疫應(yīng)答[3]。而另外一個(gè)免疫分子檢查點(diǎn)——程序性死亡受體(programmod cell death-1 recepter,PD-1)，在維持免疫平衡和免疫耐受上也有重要作用。然而，在慢性疾病和腫瘤發(fā)生時(shí)，PD-1會(huì)限制保護(hù)性免疫，從而導(dǎo)致免疫逃逸。PD-1與相應(yīng)配體結(jié)合后，會(huì)抑制CD28導(dǎo)致的T細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生并可能導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡[4]。PD-1還可抑制B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)介導(dǎo)的B細(xì)胞活化，從而抑制B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體的生成[5]。PD-1的既往研究主要集中于淋巴細(xì)胞，近年來發(fā)現(xiàn)其在巨噬細(xì)胞固有免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用。

1 PD-1的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

PD-1即CD279，是由288個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于CD28免疫球蛋白(Ig)超家族，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別為免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)由免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)和免疫受體酪氨酸抑制基序ITIM(immunor-eceptor tyrosine-based inhibitory motif)組成[6]。PD-1主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞和前體B淋巴細(xì)胞，在初始T細(xì)胞上不表達(dá)，在接觸外來抗原或自身抗原后，初始T細(xì)胞被活化從而表達(dá)PD-1[7]。PD-1的表達(dá)程度與抗原刺激程度相關(guān)，當(dāng)抗原被立刻清除(如在急性疾病發(fā)生)時(shí)，相應(yīng)T細(xì)胞上的PD-1表達(dá)量減少；而在慢性感染或者腫瘤中，由于抗原的持續(xù)刺激，T細(xì)胞上PD-1可持續(xù)高表達(dá)[8,9]。PD-1在細(xì)胞表面的表達(dá)可在刺激后24 h內(nèi)檢測(cè)，但在T淋巴細(xì)胞活化幾小時(shí)內(nèi)就可發(fā)揮功能[10]。除了T、B淋巴細(xì)胞外，PD-1還可表達(dá)于NK細(xì)胞(natural killer cells)、NKT(natural killer T cells)、活化單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞DCs(dendritic cells)等髓系細(xì)胞、APC細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞和固有淋巴細(xì)胞[6，11，12]。PD-1在活化T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)主要受NFATC1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1)、FOXO1 (forkhead box protein O1)，T-bet(T-box expressed T-cells)和BLIMP1 (B lymphocyte-induced maturation protein 1)等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[13]。此外，PD-1表達(dá)可能還受表觀修飾調(diào)控，使其在抗原被清除后還能持續(xù)表達(dá)，但具體機(jī)制還有待深入研究[14]。在腫瘤微環(huán)境中，PD-1表達(dá)上調(diào)，其配體表達(dá)水平也會(huì)隨之增高[15]。

2 PD-1配體

PD-1通過與其配體PD-L1(programmed death-ligand 1，即B7-H1，CD274)和PD-L2(即B7-DC)結(jié)合發(fā)揮功能[16]。PD-L1和PD-L2主要區(qū)別在于其表達(dá)模式。PD-L1廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，其在淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等造血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞及各種腫瘤細(xì)胞系等非造血細(xì)胞上均有分布[6，17]。前炎癥因子如Ⅰ型和Ⅱ型干擾素、TNF-α、IL-27等都可促進(jìn)PD-L1表達(dá)[18，19]。以干擾素為代表的細(xì)胞因子是PD-L1的主要調(diào)節(jié)分子，其在腫瘤中會(huì)形成適應(yīng)性免疫耐受，即由T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的前炎癥因子會(huì)上調(diào)PD-L1表達(dá)，是PD-1/PD-L1作為免疫檢查點(diǎn)的重要負(fù)反饋機(jī)制。PD-L2的表達(dá)相較于PD-L1相對(duì)局限，其主要分布于DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓來源肥大細(xì)胞，可被一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)，如IL-4、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IFN-γ等[20-22]。PD-L1和PD-L2與PD-1的親和力也不同，PD-L2與PD-1結(jié)合親和力約為PD-L1的3倍[17]。

3 PD-1胞內(nèi)信號(hào)和分子機(jī)制

PD-1信號(hào)通路的研究主要在活化T淋巴細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。PD-1通過與其配體結(jié)合導(dǎo)致ITSM/ITIM基序磷酸化，從而招募酪氨酸磷酸酶(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-1，SHP-1)和SHP-2，SHP-1和SHP2可通過使相應(yīng)激酶去磷酸化從而抑制這些激酶活化，比如可通過抑制PI3K-Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B)通路及磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)和其下游的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制TCR受刺激后導(dǎo)致的T細(xì)胞存活、活化、增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及細(xì)胞內(nèi)代謝改變，提示PD-1在T細(xì)胞免疫耐受和腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要功能[4，17，23，24]。

4 巨噬細(xì)胞的分類和功能

巨噬細(xì)胞功能的多樣性導(dǎo)致其存在多種分類方式。根據(jù)其免疫功能可分為M1型巨噬細(xì)胞即經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages)和M2型巨噬細(xì)胞即替代激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages)[25]。M1型巨噬細(xì)胞在IFN-γ、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、GM-CSF等刺激下分泌IL-1β、TNF-α及IL-12等促炎癥因子，協(xié)助Th1細(xì)胞發(fā)揮抗感染功能[26]。M2型巨噬細(xì)胞是在Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-4和IL-13等作用下分化形成，主要參與纖維化、組織修復(fù)和體液免疫，是一種“抗炎性”巨噬細(xì)胞[27]。腫瘤中存在一群腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，TAM并不是嚴(yán)格意義上的巨噬細(xì)胞亞群，其不在穩(wěn)態(tài)條件下存在，而是存在于許多腫瘤中。TAMs具有表型可塑性，其可在不同的微環(huán)境中會(huì)發(fā)生不同的極化，既可向炎性的M1型極化，也可向M2型(pro-tumor)分化，M2型巨噬細(xì)胞與腫瘤血管生成及代謝相關(guān)，并通過分泌細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[28-30]。成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞中ERK1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2)信號(hào)通路增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量單核細(xì)胞趨化因子CCL2/MCP1(chemokine C-C motif ligand 2/monocyte chemotactic protein 1)和CSF1/MCSF(colony-stimulating factor 1/monocyte colony-stimulating factor)，導(dǎo)致大量TAMs浸潤(rùn)，并向M2極化，重塑腫瘤微環(huán)境。

5 PD-1在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)及對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控

PD-1主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞，目前大部分研究焦點(diǎn)都集中于T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)及對(duì)其的阻斷效應(yīng)上。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在固有免疫應(yīng)答中也可發(fā)揮作用。

PD-1的表達(dá)對(duì)DC細(xì)胞功能起負(fù)調(diào)控作用，PD-1敲除小鼠對(duì)李斯特菌感染的抵抗能力增強(qiáng)，分泌更多的IL-12和TNF-α[31]。PD-1在巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)[32，33]，但相比于活化狀態(tài)的T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平較低，需要一定的刺激活化，如LPS、IFN-α等[32-35]。當(dāng)給予RAW264.7細(xì)胞系LPS刺激時(shí)，其會(huì)上調(diào)PD-1表達(dá)，并通過募集SHP-2到PD-1胞漿尾部結(jié)構(gòu)域，抑制JNK(c-Jun N-terminal kinase)和PI3K/Akt信號(hào)通路活化，從而影響巨噬細(xì)胞功能成熟及共刺激分子表達(dá)[34]。

5.1PD-1與TAMs 有研究發(fā)現(xiàn)在病原體感染時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)在腫瘤中表達(dá)高水平的PD-1，但其機(jī)制目前尚不明確。PD-1+TAMs有類似于M2型巨噬細(xì)胞的表面分子表達(dá)模式和功能，如CD206和IL-10表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)；HLA-DR、CD64和IL-12表達(dá)降低；抑制CD8+T細(xì)胞能力顯著增強(qiáng)，其中單核細(xì)胞分化為PD-1+TAMs在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)M2表型可能與腫瘤來源的外泌體相關(guān)[36]。而PD-1-TAMs的表達(dá)譜則與M1型巨噬細(xì)胞相似，Gordon等[37]發(fā)現(xiàn)PD-1+TAM吞噬腫瘤細(xì)胞能力受到抑制，提示阻斷PD-1/PD-L1通路治療可能通過影響巨噬細(xì)胞功能發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PD-1敲除后，酵母聚糖可促進(jìn)炎癥發(fā)生，巨噬細(xì)胞向M1型而不是M2型極化，可能是由于PD-1敲除后胞內(nèi)STAT1/NF-κB活化增強(qiáng)，同時(shí)STAT6信號(hào)通路活化減弱。

5.2PD-1與巨噬細(xì)胞凋亡 PD-1在許多凋亡細(xì)胞上過表達(dá)，可介導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[38]。有研究發(fā)現(xiàn)PD-1還與巨噬細(xì)胞的凋亡相關(guān)。雙氧水處理后的巨噬細(xì)胞PD-1表達(dá)增加，其通過PD-1-SHP2通路抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和存活通路AKT活化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡增加。而當(dāng)杜氏利氏曼蟲感染巨噬細(xì)胞時(shí)，其可通過使活化T-細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells，NFATc1)失活降低PD-1表達(dá)，從而抑制巨噬細(xì)胞凋亡[39，40]。

5.3巨噬細(xì)胞上PD-1的表達(dá)與炎癥 膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其過度且失控的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致免疫功能障礙，最終造成持續(xù)感染和嚴(yán)重的機(jī)體損傷[41]。巨噬細(xì)胞在這個(gè)過程中起關(guān)鍵作用，因?yàn)楣逃忻庖呤撬拗鞯挚垢腥镜牡谝坏婪谰€，巨噬細(xì)胞能高效清除病原體，并且是炎癥因子最重要的來源[42]。PD-1/PD-L1途徑可能對(duì)膿毒癥起重要調(diào)控作用。在膿毒癥發(fā)生過程中，腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平PD-1，這與巨噬細(xì)胞失能相關(guān)。清除PD-1髓系敲除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后，小鼠抗菌能力減弱，炎癥因子增多，致死率升高。PD-1可能不僅是巨噬細(xì)胞失能的標(biāo)志，也可能是調(diào)節(jié)固有免疫反應(yīng)的重要靶點(diǎn)[33]。

6 小結(jié)

PD-1作為重要的免疫抑制分子，不僅在T、B淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能，還在固有免疫細(xì)胞——巨噬細(xì)胞上有一定表達(dá)。高表達(dá)PD-1的巨噬細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡及炎癥發(fā)生息息相關(guān)。巨噬細(xì)胞上PD-1分子的表達(dá)及功能研究表明PD-1在固有免疫中也具有重要調(diào)控作用，為課題組針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的治療提供了廣泛且具體的思路。