陳小冰 張雪梅 陳求凝 謝邦貴 盧玉朱

(海南省第三人民醫(yī)院新生兒科，三亞 572000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒癥最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，在膿毒癥患兒中的發(fā)病率及病死率均較高，嚴(yán)重威脅患兒的生命健康[1]。早期診斷及干預(yù)是改善AKI預(yù)后的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)仍使用血肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素C(cystatin C，Cys-C)及腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)評(píng)價(jià)早期腎損傷，但敏感性不高，無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)作為新型的基因調(diào)控分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[2，3]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p通過(guò)多種機(jī)制參與AKI的發(fā)生發(fā)展，是AKI 發(fā)病的重要調(diào)控因子，為理解AKI的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角[4]。本研究通過(guò)觀察膿毒癥患兒血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平分析其對(duì)AKI的早期預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2016年1月～2019年6月海南省第三人民醫(yī)院收治的膿毒癥患兒196例，其中男性126例，女性70例，年齡8個(gè)月～14歲，平均年齡(6.20±1.58)歲。兒童膿毒癥的診斷參考兒童膿毒性休克診治專(zhuān)家共識(shí)(2015版)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高或下降，發(fā)熱(肛溫>38.5℃)或低體溫(肛溫<35℃)；②心動(dòng)過(guò)速(低體溫者可以無(wú)心動(dòng)過(guò)速)，伴隨至少一個(gè)臟器功能異常(意識(shí)改變、低氧血癥、血清乳酸增高或洪脈)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期使用激素、免疫抑制劑者；②有慢性腎臟病史，接受過(guò)腎臟手術(shù)、近期接受造影劑檢查及使用過(guò)腎毒性藥物者；③伴有惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、慢性肝病及自身免疫性疾病者[5]。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬知情同意。

1.1.2試劑與儀器 ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；BR100207 PCR試劑盒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；RNeasy試劑盒、miRNA Easy試劑盒和TRIzol試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；miR-182-5p引物由上海遠(yuǎn)見(jiàn)生物公司合成；離心機(jī)為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1收集資料及分組 參考2012版《KDIGO急性腎損傷臨床實(shí)踐指南》制定的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組[6]。腎功能在48 h內(nèi)突然減退，表現(xiàn)為Scr絕對(duì)值升高(≥26.5 μmol/L)，或Scr較基礎(chǔ)值升高≥50%；或尿量減少(<0.5 ml/kg·h)，并持續(xù)>6 h。設(shè)AKI的膿毒癥患兒為AKI組(72例)，未繼發(fā)AKI的膿毒癥患兒為非 AKI 組(124例)。記錄所有患兒入院時(shí)的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)疾病、感染部位、心率、呼吸、體溫、尿量、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(acute physiology and chronic health scoring system Ⅱ，APACHEⅡ)及序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment，SOFA)等基本情況。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)miR-182-5p miR-182-5p引物上游：5′-ACTACTTCGACTGAGACACG-3′，下游：5′-GTCTGCATGCTGTCCTTG-3′。所有患兒均于入院次日采集空腹靜脈血5 ml置于未加抗凝劑的離心管中3 500 r/min離心10 mm分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩RT-PCR檢測(cè)miR-182-5p含量。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置20 μl反應(yīng)體系,擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃復(fù)性60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-182-5p的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3觀察指標(biāo) 所有患兒均于入院次日采集空腹靜脈血5 ml置于未加抗凝劑的離心管中，37℃水浴30 min，以離心半徑13.5 cm，3 500 r/min離心10 min，分離血清保存于-80℃冰箱待檢。采用微粒子酶免疫分析法檢測(cè)Scr及Cys-C水平，ELISA檢測(cè)KIM-1水平。

2 結(jié)果

2.1AKI組和非AKI組臨床一般資料比較 兩組患兒的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、感染部位、心率、呼吸及體溫差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；尿量、APACHEⅡ評(píng)分及SOFA評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AKI組和非AKI組臨床一般資料比較

2.2AKI組和非AKI組血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平比較 AKI組患兒血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明顯高于非AKI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 AKI組和非AKI組血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平比較

2.3多因素Logistic回歸分析比較膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素 對(duì)AKI組和非AKI組有影響的因素分別為尿量、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分、miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平升高是膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其OR(95%CI)值分別為2.903(1.870～5.116)、1.704(1.105～2.940)、2.063(1.434～3.970)、2.530(1.524～4.613)。見(jiàn)表3。

表3 多因素Logistic回歸分析膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素

2.4血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平對(duì)AKI的早期預(yù)測(cè)價(jià)值 血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平預(yù)測(cè)膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的最佳截值分別為1.04、325.60 μmol/L、1.24 mg/L、16.50 μg/L，其中血清miR-182-5p表達(dá)水平預(yù)測(cè)膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的敏感度和特異度較好。4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的AUC(0.956，95%CI：0.903～0.997)明顯高于單項(xiàng)miR-182-5p(0.852，95%CI：0.791～0.912)、Scr(0.735，95%CI：0.675～0.797)、Cys-C(0.796，95%CI：0.741～0.853)及KIM-1(0.817，95%CI：0.763～0.882)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.827、7.374、6.418、6.205，P<0.05)，其敏感度和特異度分別為96.4%和90.8%。見(jiàn)表4。

表4 血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平對(duì)AKI的早期預(yù)測(cè)價(jià)值

2.5血清miR-182-5p表達(dá)水平與Scr、Cys-C及KIM-1的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，AKI組血清miR-182-5p表達(dá)水平與Scr、Cys-C及KIM-1均呈正相關(guān)(r=0.683、0.975、0.874，P<0.01)，見(jiàn)圖1。非AKI組血清miR-182-5p表達(dá)水平與Scr、Cys-C及KIM-1均無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.106、0.131、0.162，P>0.05)。

圖1 血清miR-182-5p表達(dá)水平與Scr、Cys-C及KIM-1的相關(guān)性

3 討論

膿毒癥患兒繼發(fā)AKI是一種常見(jiàn)急危重癥，其病情進(jìn)展迅速，病死率較高，已成為兒童死亡的主要原因之一。由于目前缺乏對(duì)AKI早期預(yù)測(cè)的敏感特異指標(biāo)，臨床實(shí)踐中往往會(huì)錯(cuò)過(guò)對(duì)AKI早期診斷及干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)。因此，探索一種敏感度和特異度強(qiáng)的生物標(biāo)志物以提高對(duì)膿毒癥患兒AKI的早期識(shí)別能力，對(duì)改善膿毒癥患兒預(yù)后至關(guān)重要。miRNA是一類(lèi)由18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過(guò)影響細(xì)胞缺血缺氧、細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等多種病理過(guò)程或信號(hào)通路參與AKI調(diào)控[7，8]。有研究表明，miRNA是AKI發(fā)病的重要調(diào)控因子，其通過(guò)多種機(jī)制參與不同病因?qū)е碌腁KI，是AKI早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[9]。Wilflingseder等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p是移植后AKI的調(diào)節(jié)因子，與AKI期間的整體基因表達(dá)變化密切相關(guān)，在AKI發(fā)病機(jī)制和組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有望作為AKI新的生物標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊。亦有研究認(rèn)為，miRNA在 AKI中表達(dá)異常，在AKI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為早期干預(yù)AKI進(jìn)展提供新思路，有望作為AKI早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[11]。

本研究顯示，AKI組血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明顯高于非AKI組，提示血清miR-182-5p可能參與AKI的發(fā)生發(fā)展。Zhang等[12]研究表明，miRNA在膿毒癥繼發(fā)AKI中顯著升高，可反映疾病的嚴(yán)重程度，其水平越高膿毒癥患者死亡率越高，可能成為AKI新的診斷標(biāo)志及治療靶點(diǎn)。Xie等[13]研究認(rèn)為，KIM-1能迅速反映近曲小管損傷，對(duì)腎臟功能損害具有較高的特異度和敏感度，可用于AKI的早期預(yù)測(cè)。本研究多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平升高是膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。李大勇等[14]研究顯示，miRNA表達(dá)升高是膿毒癥患者發(fā)生AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為AKI的早期預(yù)測(cè)因子，具有較高的診斷效能。王軍宇等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Cys-C及KIM-1水平升高是AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且與AKI的嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)急診危重癥患者7 d內(nèi)AKI發(fā)生的敏感指標(biāo)。本研究ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平預(yù)測(cè)膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的最佳截值分別為1.04、325.60 μmol/L、1.24 mg/L、16.50 μg/L，四項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的曲線(xiàn)下面積(0.956，95%CI：0.903～0.997)最大，其敏感度和特異度較高。Pearson相關(guān)分析顯示，AKI組血清miR-182-5p表達(dá)水平與Scr、Cys-C及KIM-1均呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-182-5p與Scr、Cys-C及KIM-1聯(lián)合檢測(cè)有助于提高AKI早期診斷的準(zhǔn)確性。Ren等[16]研究表明，在腎損傷發(fā)生后很短時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)miRNA表達(dá)水平，miRNA可作為血肌酐和尿量的輔助指標(biāo)，有助于AKI的早期診斷、預(yù)后判斷和監(jiān)測(cè)病情發(fā)展。Zheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA表達(dá)量在腎缺血再灌注損傷的不同階段及不同缺血時(shí)間會(huì)發(fā)生不同程度的變化，與AKI病情嚴(yán)重程度相關(guān)，有望成為新的AKI診斷、分類(lèi)和預(yù)后判斷的工具。另有研究顯示，膿毒癥患者AKI組血清Cys-C、尿液KIM-1水平明顯高于非AKI組，能更早的反映腎臟損傷情況，檢測(cè)該指標(biāo)有助于判斷膿毒癥患者是否發(fā)生AKI[18]。

綜上所述，血清miR-182-5p表達(dá)在膿毒癥患兒繼發(fā)AKI中明顯升高，是膿毒癥患兒繼發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望作為AKI早期預(yù)測(cè)的新型生物標(biāo)志物。miR-182-5p聯(lián)合Scr、Cys-C及KIM-1水平對(duì)預(yù)測(cè)AKI具有較高的價(jià)值，同時(shí)也為闡明AKI發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供了新的角度。