劉典鋒 王安鳳 何惠忠

(攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，攀枝花 617000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)多見于女性，是一種多因素介導(dǎo)的自身免疫疾病[1]。免疫調(diào)節(jié)、基因、環(huán)境、荷爾蒙激素和表觀遺傳等異常都有可能導(dǎo)致SLE的發(fā)生，引起先天和后天免疫反應(yīng)[2]，并對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞以及一些細(xì)胞和體液組分產(chǎn)生功能上的影響[3]。研究證實(shí)，外周血單個(gè)核細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其增殖和凋亡與SLE的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs)在骨髓中具有成骨前體細(xì)胞的潛能，并擁有免疫調(diào)節(jié)，免疫抑制以及再生功能[5]。目前BMMSCs移植同樣也被應(yīng)用于治療SLE[6]。在細(xì)胞間交流過程中，可由包含56個(gè)蛋白和核酸的外泌體介導(dǎo)形成[7]，根據(jù)產(chǎn)生外泌體的來源細(xì)胞類型，外泌體可產(chǎn)生不同的功能，例如介導(dǎo)免疫抑制或者免疫刺激等，干細(xì)胞可應(yīng)用于腫瘤和自身免疫疾病的治療中[8]。大量研究表明，外泌體miRNA在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。miRNA同樣參與到SLE的調(diào)控中[9-12]。本研究將探討在骨髓干細(xì)胞移植中，BMMSCs外泌體調(diào)控SLE細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(貨號(hào)：PT-2501；Lonza)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞取自攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。

1.1.2試劑 DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和FBS購自Gibco；POROSTMHeparin 50 μm購自Thermofisher；Ficoll?400購自Sigma-Aldrich；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScripTMRT reagent kit以及qRT-PCR試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa；外泌體RNA提取試劑盒SeraMir Exosome RNA Column Purification Kit購自System Biosciences；Trizol核酸提取試劑盒和Lipofectamine 3000購自Invitrogen；RIPA蛋白裂解液和Annexin V-FITC試劑盒購自碧云天公司；CCK-8試劑盒購自Abcam；qRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；一抗(antibody-CD9、antibody-CD63、antibody-TSG101、antibody-UVRAG)和HRP標(biāo)記二抗(山羊抗兔igG)購自Promega。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BMMSCs細(xì)胞培養(yǎng)于含有1%青霉素和10% FBS(使用前100 000 g離心8 h去除血清的外泌體)DMEM培養(yǎng)基中，控制細(xì)胞濃度于1×106個(gè)/瓶，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換一次培養(yǎng)基，達(dá)到80%融合度后使用胰酶消化懸浮用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2。培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2BMMSCs來源外泌體以及SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 BMMSCs來源外泌體分離：取使用無外泌體FBS培養(yǎng)48 h后的BMMSCs條件培養(yǎng)基用于分離提取外泌體。10 000 g離心30 min除掉細(xì)胞碎片，PBS重懸后100 000 g離心70 min，重復(fù)兩次。最后用30 μl PBS洗滌，保存于-80℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用透射電子顯微鏡和Western blot分別對(duì)所提取外泌體形態(tài)以及表面標(biāo)記物CD9、CD63和TSG101進(jìn)行檢測(cè)。SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞分離：肝素鈉抗凝管收集SLE外周血，采用Ficoll-Paque試劑配合密度梯度離心分離SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞和外泌體中miRNA水平 使用外泌體RNA提取試劑盒提取外泌體中總RNA，具體方法參照試劑盒說明。Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，miRNA測(cè)定采用qRT-PCR試劑盒。RT-PCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX Reference Dye(50×)0.4 μl、cDNA模板2 μl、ddH2O 6 μl。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s一共40個(gè)循環(huán)。各miRNA以及內(nèi)參U6引物見表1。

表1 引物序列

1.2.4CCK-8檢測(cè)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活性 將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μl無FBS的RPMI培養(yǎng)基，控制細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/孔。與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)則加入10 μg/ml外泌體于培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)至第1、2、3、4天時(shí)，分別加入10 μl CCK-8試劑染色，并繼續(xù)培養(yǎng)1 h。染色完成后在450 nm波長下檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡率 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后，參照試劑盒說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin Ⅴ-FITC/PI染色標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-10a-5p與UVRAG靶向關(guān)系 UVRAG 3′UTR中可能與miR-10a-5p具有靶向位點(diǎn)的序列及其突變序列分別插入到Pglo載體中，分別構(gòu)建質(zhì)粒Pglo-UVRAG-WT和Pglo-UVRAG-MUT。在SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-10a-5p和UVRAG野生型質(zhì)?；蛲蛔冃唾|(zhì)粒。采用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作參照試劑盒使用說明。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h后加入裂解緩沖液，最后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.7Western blot檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記物以及UVRAG表達(dá)水平 細(xì)胞經(jīng)PBS重懸洗滌后，RIPA提取總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，膜經(jīng)TBST洗滌，5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗(CD9，1∶2 000；CD63，1∶2 000；TSG101，1∶2 000；UVRAG，1∶2 000)4℃過夜孵育，孵育完后除去一抗并洗滌。加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，于37℃孵育1 h。最后加入化學(xué)顯色液，成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1成功分離BMMSCs來源外泌體 透射電子顯微鏡拍攝圖片顯示，BMMSCs外泌體呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則圓形，直徑約30～100 nm，如圖1A所示。Western blot結(jié)果顯示，外泌體表面標(biāo)記物CD9，CD63以及TSG101均表達(dá)，如圖1B所示。結(jié)果表明BMMSCs外泌體分離成功。

圖1 成功分離BMMSCs來源外泌體

2.2BMMSCs來源外泌體抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡 CCK-8結(jié)果顯示，SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)后第3、4天，細(xì)胞增殖活力對(duì)比對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，如圖2A所示。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，共培養(yǎng)后，PBMC凋亡率顯著升高(P<0.01)，如圖2B、C所示。結(jié)果表明，BMMSCs來源外泌體會(huì)抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

圖2 BMMSCs來源外泌體抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

2.3BMMSCs來源外泌體上調(diào)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中異常低表達(dá)的miRNA：miR-155，miR-17，miR-181b和miR-10a-5p，與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)后，這些miRNA水平均顯著升高(P<0.05)，并且其中miR-10a-5p表達(dá)水平上調(diào)最高(P<0.01)，如圖3所示。結(jié)果表明，SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中低表達(dá)miRNA水平可被BMMSCs外泌體上調(diào)，其中miR-10a-5p上調(diào)最為顯著。

圖3 BMMSCs來源外泌體顯著上調(diào)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)水平

2.4BMMSCs來源外泌體中miR-10a-5p抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡 qRT-PCR結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染antagomiR-10a-5p后，細(xì)胞中miR-10a-5p水平顯著降低(P<0.01)，如圖4A所示。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，Exo組在第3、4天時(shí)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活力相比于對(duì)照組顯著降低，而將Exo中miR-10a-5p敲降后第3、4天，SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活力相比于Exo組顯著升高(P<0.01)，如圖4B所示。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，Exo組凋亡率顯著升高(P<0.01)，但敲降外泌體中miR-10a-5p后，SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡率相比于Exo組顯著降低(P<0.01)，如圖4C、D所示。由此可知，抑制外泌體miR-10-5p水平可促進(jìn)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖從而抑制其凋亡。

圖4 敲降BMMSCs來源外泌體miR-10a-5p促進(jìn)SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并抑制其凋亡

2.5miR-10a-5p靶向下調(diào)UVRAG表達(dá) starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，UVRAG 3’UTR與miR-10a-5p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，如圖5A所示。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于miR-NC+UVRAG WT組，miR-10a-5p+UVRAG WT組熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，如圖5B所示，并且miR-NC+UVRAG MUT組熒光強(qiáng)度與miR-10a-5p+UVRAG MUT組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-10a-5p mimics后，SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中UVRAG表達(dá)水平相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，如圖5C所示。由此可知，在SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-10a-5p靶向下調(diào)UVRAG表達(dá)。

圖5 miR-10a-5p靶向下調(diào)UVRAG表達(dá)水平

2.6BMMSCs外泌體miR-10a-5p下調(diào)UVRAG抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡 Western blot結(jié)果顯示，相比于NC組，Exo組和敲降UVRAG組中UVRAG蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，同時(shí)敲降miR-10a-5p和UVRAG組中UVRAG的表達(dá)水平與NC組相比無差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖6A所示。將Exo與SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后的SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)果顯示，相比較于Exo組，敲降UVRAG且與Exo共培養(yǎng)可明顯抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖(P<0.01，如圖6所示)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05，如圖6C所示)，與Exo共培養(yǎng)且同時(shí)敲降miR-10a-5p和UVRAG組中細(xì)胞的增殖和凋亡水平與NC組相比無明顯變化。綜上可知，BMMSCs外泌體miR-10a-5p靶向下調(diào)UVRAG，抑制SLE外周血單核細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖6 BMMSCs來源外泌體miR-10a-5p下調(diào)UVRAG表達(dá)水平從而抑制SLE外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種多因素介導(dǎo)的自身免疫疾病，發(fā)病率在26/100 000至52/100 000間，女性約為1/1 000[13]，并影響腎臟、腦、肺和造血系統(tǒng)功能?？刹捎妙惞檀迹h(huán)磷酰胺以及其他免疫抑制藥物如霉酚酸酯對(duì)SLE進(jìn)行治療，但是治療效果并不理想，而且這類治療方法容易產(chǎn)生感染，卵巢功能衰竭，繼發(fā)性腫瘤等副作用[14-16]。在對(duì)BMMSCs的研究中，發(fā)現(xiàn)SLE患者BMMSCs在細(xì)胞因子(如生長因子β)分泌以及白介素6/7基因的轉(zhuǎn)錄都異于正常BMMSCs，并且也有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者BMMSCs在增殖和免疫調(diào)控中都異于正常BMMSCs，表明BMMSCs在SLE的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用[17]。并且有研究表明，BMMSCs能夠抑制T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞增殖活力[18-20]。BMMSCs也已被應(yīng)用SLE的治療，并產(chǎn)生良好的治療效果[21，22]。

BMMSCs可通過將細(xì)胞中包括細(xì)胞器(如線粒體)、蛋白、基因以及miRNA等物質(zhì)包裹于外泌體微泡中，從而進(jìn)行細(xì)胞間交流[23，24]。而這類外泌體miRNA在許多生理過程中都發(fā)揮著重要作用，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。BMMSCs外泌體miR-29b-3p可調(diào)控2型糖尿病胰島素耐藥性[25]。在心臟疾病的治療中，BMMSCs外泌體miR-21-5p通過調(diào)控PI3K信號(hào)通路影響肌肉收縮和鈣調(diào)控[26]。同時(shí)也有研究表明，BMMSCs通過外泌體調(diào)控接收細(xì)胞中miRNA水平，并進(jìn)而調(diào)控下游通路對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響[27]。在本研究中，探討了BMMSCs外泌體miR-10a-5p對(duì)SLE細(xì)胞的調(diào)控。

大量研究表明，miR-10a-5p在多種細(xì)胞中影響細(xì)胞增殖與凋亡。在宮頸癌中，miR-10a-5p通過靶向調(diào)控BDNF抑制腫瘤細(xì)胞增殖[28]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)中，miR-10a-5p可調(diào)控TBX5，從而對(duì)滑膜炎細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響[29]。miRNA通常通過靶向調(diào)控下游mRNA，影響其在細(xì)胞中的水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能。在本研究中，探討了在BMMSCs移植中，外泌體miR-10a-5p通過UVRAG調(diào)控SLE細(xì)胞增殖與凋亡。

對(duì)于皮膚癌癥，暴露于紫外光(UV)照射下可引起皮膚癌癥的惡化，而UVRAG參與調(diào)控UV敏感性[30，31]。UVRAG同時(shí)也參與調(diào)控自噬，內(nèi)吞和細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)運(yùn)等過程[32，33]。UVRAG在一些細(xì)胞如結(jié)直腸癌細(xì)胞，黑素瘤細(xì)胞等中，由miRNA調(diào)控參與細(xì)胞增殖凋亡等過程[34，35]。同時(shí)也有研究表明，miR-125b通過靶向調(diào)控UVRGA并抑制SLE患者的自噬過程[36]。而在本研究中，對(duì)BMMSCs分泌miR-10a-5p進(jìn)而調(diào)控UVRAG參與SLE細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行了闡述。

綜上所述，在BMMSCs移植后，BMMSCs通過分泌外泌體miR-10a-5p下調(diào)SLE細(xì)胞中UVRGA表達(dá)，從而抑制SLE細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。為BMMSCs治療SLE的分子機(jī)制提供了新的思路；并進(jìn)一步闡述了UVRAG對(duì)SLE細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生的影響，為UVRAG的功能研究提供了理論支持。結(jié)合UVRAG在SLE細(xì)胞中產(chǎn)生的影響，可進(jìn)一步研究UVRAG在SLE細(xì)胞中的作用網(wǎng)絡(luò)。